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癌症是严重威胁人类健康的一大类疾病,运用科学的方法对癌症进行预防控制已成为全球最重要的公共卫生问题之一。目前癌症的治疗方法主要有外科手术、化学治疗和放射治疗等,但这些方法对患者造成的创伤大、毒副作用强,甚至对免疫系统会产生抑制。因此,开发高效、低毒、微创的新型抗癌方法已成为全球研究的热点。近年来,光动力疗法（photodynamic therapy,PDT）利用氧分子、光敏剂和激光治疗肿瘤,在治疗过程中用特定波长的光源激活光敏剂,活化周围的氧从而产生大量活性氧（reactive oxygen species,ROS）,用以杀伤癌细胞。与传统肿瘤疗法相比,PDT有微创、高效、副作用较小等显著优势,是一种精准、有效的治疗方式。目前临床上所用光敏剂可以通过口服、注射以及局部给药。由于市售光敏剂及所用激发光的理化性质,使PDT在临床应用中存在一些局限:第一,PDT所用激光的穿透力较弱,有效作用范围仅有数毫米,使PDT局限于皮肤浅表部位及脏器空腔内表面癌症的治疗;第二,常用的光敏剂水溶性差且易聚集,影响治疗效率,除此之外,其对肿瘤组织缺乏靶向性,静脉注射后难以在病灶区域富集;第三,由于激发光波长在可见光区,且光敏剂全身分布,所以患者在接受光动力治疗的过程中为了减少光毒性副作用,必须避免与可见光接触。本文开展了胶束复合温敏凝胶给药系统应用于双光子光动力疗法的研究。首先选择了疏水的新型有机小分子双光子化合物T1作为双光子光动力疗法体系中的能量转换器。T1由咪唑、三苯胺和苯乙烯基构建的D-π-A发色团组成,具有双光子吸收截面积较大、光稳定性较好等优势,能吸收近红外激光并将能量转移至光敏剂焦脱镁叶绿酸a（pyropheophorbide a,PPa）,产生治疗作用,实现双光子光动力疗法以增加治疗深度。其次,以聚乙二醇单甲醚-聚乳酸[methoxy poly（ethylene glyeol）-polylactic acid,mPEG-PDLLA]为胶束材料,共同包载T1和PPa,既解决光敏剂疏水、易聚集的问题,又缩小供体和受体之间的距离,有利于提高能量转移效率,增加单线态氧（singlet oxygen,1O2）的产生量。第三,构建了一种长效的胶束-温敏凝胶复合载药系统,瘤内注射后在局部形成药物贮库,控制药物的释放,提高治疗效果。主要研究内容分为以下四个部分。第一部分,载药胶束的制备及表征。mPEG-PDLLA有若干不同分子量的规格,本研究以mPEG2000-PDLLA2000为胶束材料,使用薄膜水化法制备双光子化合物T1和PPa的共载药胶束（dual-load micelle,DLM）;用紫外可见分光光度法对T1和PPa定量;采用透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）和动态光散射激光粒度仪（dynamic light scattering,DLS）测定胶束的形态及粒径;用双光子诱导荧光法,测定胶束中T1的双光子吸收截面积;以9,10-二苯基蒽丙酸钠（anthracene-9,10-dipropionic acid disodium salt,ADPA）为1O2的探针检测1O2产生量;采用透析法考察DLM的体外释放度以及释放机理。结果:DLM中共同包载了T1和PPa,该胶束形态近似为球形,平均粒径为153.9±2.6 nm,PDI为0.154±0.062,Zeta电位值为-9.38±0.36 mV,T1和PPa包封率分别为74.9±1.4%和76.3±1.2%;胶束中T1在808 nm处具有较大的双光子吸收截面积（δ=293.7（37）/GM）;ADPA在400 nm处的吸光度值减小,光照30 min后下降了0.21±0.02;DLM在PBS溶液中48 h内的药物累计释放率均达到70%以上,其Ritger-Pappas方程拟合结果表明药物扩散和骨架溶蚀是胶束释放药物的机制。第二部分,胶束复合温敏凝胶的制备及表征。以泊洛沙姆407（poloxamer 407,P407）为温敏凝胶材料,制备DLM胶束复合温敏凝胶（DLM-gel）;以胶凝温度(Tsol-gel)、流变学性质为考察指标,优化凝胶系统处方;TEM观察胶束在凝胶环境中的形态,扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM）观察凝胶的微观结构;采用无膜溶出模型测定凝胶的溶蚀速度;建立三维细胞模型考察药物体外扩散及药物消除。结果:经处方筛选后DLM-gel的Tsol-gel为33.8±0.3°C,与振荡升温条件下流变学性质考察的结果相一致;TEM图中胶束在凝胶中仍保持近球形的形态;SEM中凝胶为孔径均一的三维层状结构;胶束-温敏凝胶剂溶蚀重量与时间成正比,说明凝胶溶蚀是凝胶控制药物释放的主要因素;三维细胞模型中扩散实验结果证实温敏凝胶能降低和控制药物在组织中的扩散速度和消除速度。第三部分,胶束复合温敏凝胶的体外药效考察。采用MTT比色法评价DLM-gel对4T1细胞的光/暗毒性;利用流式细胞术检测4T1细胞对胶束复合温敏凝胶中药物的摄取速率;采用双光子共聚焦显微镜观察细胞对胶束的摄取行为;Lambda Stack扫描并测定DLM的荧光发射图谱;采用活性氧检测试剂盒（2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCHF-DA）检测细胞内的ROS水平。结果:细胞暗毒性实验中,胶束、胶束复合温敏凝胶无暗毒性;细胞光毒性实验中,细胞存活率随着激光光照时间和强度的增加而下降,最优光照功率和时间分别为0.5 W/cm2和180s;细胞摄取速率:游离药物>载药胶束>胶束复合温敏凝胶;细胞摄取药物后,T1和PPa存在于细胞质中,且有较大部分的空间重叠;发现DLM被808 nm激光激发后在680 nm出现了PPa的特征发射峰,进一步证明细胞内能量供体T1与受体PPa之间可以实现荧光能量共振转移效应（fluorescence resonance energy transfer,FRET）;经光照后细胞内ROS水平显著增加。第四部分,小鼠皮下乳腺癌模型的建立及药效学考察。建立4T1小鼠皮下乳腺癌模型,利用小动物活体成像仪观察DLM-gel的滞留时间和在主要器官的分布情况;以肿瘤体积、抑瘤率和小鼠体重为指标,进行药效考察;通过分别对心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织的病理学组织检查评价胶束复合温敏凝胶对主要脏器的毒性及诱导肿瘤细胞坏死的情况;通过组织相容性试验考察给药系统的生物相容性。结果:动物活体成像显示,瘤内注射胶束复合温敏凝胶14天后,在肿瘤部位仍有滞留;双光子光动力疗法可以有效抑制肿瘤组织的生长,且对小鼠生长无明显影响;H&E切片显示各组小鼠心、肝、脾、肺和肾均未见明显组织损伤或坏死,而肿瘤经给药光照后有明显的肿瘤组织坏死;早期发生轻微的炎症反应,但随着时间的延长,炎性细胞明显减少,并接近正常,表明该温敏凝胶具有良好的生物相容性。综上所述,薄膜水化法制备出粒径较小、带负电荷的DLM,提高了药物的水溶性,并且为FRET效应提供了合适的空间距离。冷配法制备的DLM-gel给药系统,能控制药物释放速率,延长药物滞留时间,促进肿瘤细胞对药物的吞噬。基于胶束复合温敏凝胶的双光子光动力疗法在体内外展现了较好的抗肿瘤效果,且具有良好的生物相容性,有望为光动力疗法提供一种新的手段。