旋毛虫病是由旋毛虫引起的一种重要的食源性寄生虫病。旋毛虫能够感染人、猪、犬、猫、鼠、虎、狼等150多种动物。人感染旋毛虫主要表现为发热、肌肉酸痛、腹泻、水肿、皮疹、代谢紊乱、出血等;还可能导致神经系统、心血管系统、呼吸系统的并发症;严重者可导致死亡。患病动物临床表现分为肠期和肌期,肠期在病猪主要表现为急性卡他性肠炎,而肌期主要表现为病猪、病牛发生发热、运动障碍、呼吸困难等全身症状,最后导致死亡;病猪耐过后,临床症状可以减轻而呈带虫状态。在整个生命周期中,旋毛虫一直暴露于宿主胃、小肠的消化酶以及体液的免疫酶环境中。而证据显示多种肠道线虫分泌的蛋白酶抑制剂能够减小这种宿主内环境中消化酶对其导致的损伤,同时,也能够辅助寄生性线虫吸收营养并抵抗宿主的免疫反应。而丝氨酸蛋白酶抑制剂在这些蛋白酶抑制剂中占有重要地位。丝氨酸蛋白酶抑制剂能够抑制一种或多种蛋白酶,它在动物、植物、寄生虫、病毒等的生存、繁殖发挥着重要作用。到目前为止,已经从多种寄生虫,如血吸虫、鞭虫、钩虫、绦虫和其他寄生虫体内分离并鉴定了丝氨酸蛋白酶抑制剂。这些研究表明,丝氨酸蛋白酶抑制剂在保护线虫免受宿主蛋白酶的消化作用以及与宿主相应蛋白结合而调节宿主的免疫炎症反应。这些丝氨酸蛋白酶抑制剂的能够抑制酶的活性,包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、胰弹性蛋白酶以及中性粒细胞弹性蛋白酶等。根据丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列、结构特征以及作用机制,将其分成至少18个,如kunitz、kazal、Serpin、TAP以及TIL家族。本研究从GenBank数据库中获得Tsp03044、TspAd5、Tsp03548（登录号:XM 003379333、EU263307、XM₀03379851）的全长序列,并采用各种生物信息学软件对其基本理化性质、跨膜区、信号肽、二级结构进化地位等进行了详细分析。结合蛋白跨膜区、信号肽预测发现Tsp03044、TspAd5、Tsp03548三种蛋白质均可能是分泌蛋白,并分别具有典型的Ascaris、Serpin、Kazal型结构域,分别属于Ascaris、Serpin、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂;同时,还根据各自家族的典型结构预测了三种蛋白质的重要的作用位点。另外,通过对Tsp03044、TspAd5、Tsp03548的进化关系进行分析发现:三种蛋白与各自家族成员有较高的同源性,在整体的进化分支上分别与线虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂关系较近。本研究设计并合成了扩增Tsp0304基因的引物,由旋毛虫成虫基因组中扩增出Tsp03044基因,测序正确后将其连接至载体内,构建出带有His6标签的Tsp03044原核表达载体。经过表达条件的优化,最终采用1 mM IPTG,18℃优化过夜表达可溶性的Tsp03044蛋白。另外,采用1 mM IPTG,37℃进行过夜诱导表达TspAd5和Tsp03548蛋白。并对其进行可溶性蛋白的纯化及脱盐处理。本研究首先通过荧光法测定10 mM Tris-HCl中酶-底物的反应产物的荧光值,获得各酶-底物反应的初始速率,利用双倒数法计算出酶的动力学参数Km和kcat值,进而获得各重组蛋白对三种酶的抑制常数Ki值。结果显示,32 nm的Tsp03044对胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、胃蛋白酶均有抑制作用,Ki值分别为10.05 nM、12.53 nM和1.21 nM;32 nm的TspAd5对α-糜蛋白酶和胃蛋白酶有抑制作用,其Ki值分别为9.85 nM和5.92 nM;而32 nm的Tsp03548对胰蛋白酶没有抑制作用,对α-糜蛋白酶的抑制作用非常弱（Ki=139.31 nM）,对胃蛋白酶具有较好的抑制效果（Ki=3.83 nM）。另外,本研究还采用分光光度法检测了Tsp03044、TspAd5、Tsp03548分别对凝血酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和颗粒酶B的抑制作用。本研究检测了不同温度下Tsp03044和TspAd5两种抑制剂对酶-底物反应的影响。其结果以反应的kcat值与温度的关系表示,显示了不同温度下,重组蛋白对酶将底物转化成产物的效率的影响。结果显示,37℃是各反应的最适温度,对于胰蛋白酶来说无论温度高于或低于37℃时酶将底物转化成产物的能力均下降;而由于抑制剂的存在,抑制了胰蛋白酶的作用,各温度下胰蛋白酶将底物转化的能力均较低;对于α-糜蛋白酶而言,27⁴2℃下酶活力均较好,但它不能耐受47℃的高温。Tsp03044在各温度下对α-糜蛋白酶的抑制作用均较好,而42℃时的抑制作用突然降低可能是由于测量时出现误差导致。为了鉴定三种丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性位点,本研究采用定点突变的方法制备了活性位点突变的重组蛋白,并检测了各突变蛋白对胰蛋白酶和α-糜蛋白酶的抑制效率,结果表明各突变蛋白对胰蛋白酶和α-糜蛋白酶的抑制效率均不如原蛋白,表明本研究所预测并突变的氨基酸即为该抑制剂的活性位点。为了检测Tsp03044、TspAd5、Tsp03548三种抑制剂在旋毛虫各生长时期的表达情况,本研究首先采用SYBR Green I荧光定量方法对三种基因的表达量进行定量检测,并以18S r RNA基因为内参基因,通过检测荧光定量PCR反应的Ct值,根据ΔΔCt法计算出Tsp03044、TspAd5、Tsp03548基因相对于18S rRNA的表达量。结果显示,三种抑制剂基因在旋毛虫的成虫及肌幼虫时期均有表达,但均在肌幼虫时期的表达量最大,说明三种抑制剂在旋毛虫肌幼虫时期发挥了更大的作用。而western blot方法的检测结果进一步证实了该结论。旋毛虫Ascaris、Serpin、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂Tsp03044、TspAd5、Tsp03548的成功表达纯化为检测三种蛋白的功能奠定物质基础;Tsp03044、TspAd5、Tsp03548对胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、胃蛋白酶和其他蛋白酶的抑制活性研究、各重组蛋白活性位点的鉴定以及Tsp03044、TspAd5、Tsp03548在旋毛虫各生长时期中表达量的检测也为进一步研究三种蛋白在保护旋毛虫免受宿主消化酶的消化作用等功能奠定了基础。总之,本研究结果表明Tsp03044、TspAd5、Tsp03548为有效的丝氨酸蛋白酶抑制剂,本研究结果为研究Tsp03044、TspAd5、Tsp03548基因的功能提供依据。