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抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是生物体先天性免疫系统分泌的一类小分子多肽,在大多数生物体固有防御机制中起着重要作用。因其具有广谱的抗菌活性和独特的膜作用方式,AMPs被认为是替代传统抗生素成为新型治疗剂的最佳候选。然而,其潜在的细胞毒性、生产成本高和生理稳定性较差等都阻碍着对天然AMPs的进一步应用。因此,近年来,大多数研究者们对天然AMPs氨基酸序列进行分子设计及改造,以寻找影响其活性的关键保守序列,希望最大限度地提升AMPs的抗菌活性和可利用性。本研究主要利用原核表达系统获得一种具有胰蛋白酶抑制活性的苦荞抗菌肽(Fagopyrum tataricum antimicrobial peptide,FtAMP),预测的作用位点为21位的精氨酸(Arg),并利用定点突变技术获得FtAMP-R21A和FtAMP-R21F突变体。将三个多肽的理化性质、抑制活性和抗菌活性进行比较,探究FtAMP胰蛋白酶抑制活性与抗菌活性的关系。随后,利用人工合成的方法分别合成FtAMP分子中N/C-端的α-螺旋肽(FtAMP-N和FtAMP-C),探究两个α-螺旋究竟是哪一个螺旋在起作用。然后以FtAMP为模板,选择抗菌活性最有优势发展的α-螺旋区,围绕电荷和两亲性分子结构的特征,利用螺旋轮投影和特定氨基酸残基替换的原则,对其进行分子改造。并通过对多肽结构-功能检测和活性比较,探讨FtAMP结构-功能的关系。结果表明,本实验在大肠杆菌中表达纯化获得了具有胰蛋白酶抑制活性的苦荞FtAMP,SDS-PAGE分析其纯度达到95%以上,得率约为0.55 mg/L;MALDI-TOF MS分析表明其分子量为5316.7 Da。蛋白酶抑制活性分析显示FtAMP-R21A和FtAMP-R21F基本丧失了对胰蛋白酶的抑制活性,但是他们分别对弹性蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶具有了抑制活性,即获得了两种新型蛋白酶抑制剂。也进一步表明,21位精氨酸为FtAMP对胰蛋白酶抑制活性的特异性位点。抗菌实验表明,三个多肽对康氏木霉(Trichoderma koningii),华根霉(Rhizopus chinonsis)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的生长均有明显抑制作用,但它们似乎并不影响细菌的生长。这些结果表明,FtAMP蛋白酶抑制活性的改变不会直接影响其抗菌活性。因此,FtAMP的抗菌活性归因于其分子中α-螺旋结构,实验证明,FtAMP-N和FtAMP-C都具有良好的抗菌活性。随后根据螺旋轮投影方法以FtAMP氨基酸序列为模板,构建表达了4个FtAMP突变体(FtAMP-E12A,FtAMP-E12A/E9K,FtAMP-E12A/E9A和FtAMP-E12A/E9K/T24E)。圆二色光谱分析显示4个多肽的二级结构均折叠成α-螺旋结构,在208 nm和222 nm处有典型的双负峰,从而表明在基因突变与蛋白表达的过程中并没有改变亲本肽FtAMP的空间结构。抗真菌活性分析显示,与FtAMP相比,突变体对真菌的抑制作用均有增强。尤其FtAMP-E12A/E9K突变体,其抗菌作用增强约一倍,同时诱导溶血活性并不显著,选择特异性也提高了近2倍,很有希望成为有效的抗真菌药剂。这项研究为进一步探讨抗菌肽的分子作用机制和功能提供了参考依据。