论文部分内容阅读
背景和目的:恶性淋巴瘤(malignant lymphoma,ML)是淋巴造血系统的肿瘤,按照病理类型分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin disease,HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)。在中国,每年新发恶性肿瘤中淋巴瘤约占4%,是九种常见肿瘤中的一种,其在肿瘤导致的死亡排名中居列第十位,其中又以非霍奇金淋巴瘤为主,占ML的85%~90%。弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)在组织学形态、遗传学特征、免疫表型及临床表现上都存在着高度的异质性,是NHL中最为常见的一类组织学亚型。临床上发现许多恶性淋巴瘤患者伴有乙型肝炎病毒的感染,两者的关系日益受到相关研究人员的关注。大量临床的研究数据也进一步表明NHL患者乙型肝炎病毒(HBV)感染率明显高于普通人群及其他相关性实体肿瘤的患者,恶性淋巴瘤合并HBV的感染率仅次于肝癌;同时HBV的再激活在NHL合并HBV感染患者的治疗中表现显著,这些研究和发现充分表明HBV病毒感染与淋巴瘤的发生发展存在着一定的相关性。乙型肝炎病毒(HBV)具有S、C、P以及X区4个重叠开放读码框架(ORF),HBV的X基因作为其中最小的ORF,能够编码145个氨基酸组成的蛋白,即HBx。HBx可通过多种不同的作用诱导肝细胞癌(HCC)的形成,并促其发展,其中抑制肝细胞发生凋亡在HBV导致HCC发生的过程中起到巨大的作用。然而,目前的研究和相关报道尚不能解释HBV感染在NHL的发生和进展中的作用及具体机制。因此本实验选用人弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞株SUDHL-4作为研究对象,采用脂质体转染的方法,将HBx基因转入SUDHL-4细胞株中,建立带有乙肝病毒的淋巴瘤细胞模型,研究HBx对B-NHL细胞生长侵袭转移的影响并探讨其可能的作用机制,为筛选有效的治疗药物开辟新的途径,为淋巴瘤合并HBV感染的治疗提供更多有力的理论依据。方法:1、利用分子克隆的方法构建HBx基因的真核载体pcDNA3.1-X。2、将pcDNA3.1-X通过脂质体瞬时转染转入B-NHL细胞SUDHL-4中,构建整合有HBV X基因的淋巴瘤细胞株SUDHL-4-HBx,以SUDHL-4及转染空载体的B-NHL细胞SUDHL-4-con作对照,利用CCK-8法检测转染96h内各组细胞的增殖情况,应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况。3、将pcDNA3.1-X通过脂质体转染法转入SUDHL-4后,用G418筛选稳定转染HBx的SUDHL-4细胞株,取对数期SUDHL-4、SUDHL-4-con和稳定转染的SUDHL-4-HBx细胞,利用CCK8法检测三种细胞96h的生长情况;以SUDHL-4及转染空载体的B-NHL细胞SUDHL-4-con作对照,应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况,用改良噻唑蓝法(MTT)检测细胞粘附力;用Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果:1、重组质粒双酶切结果及质粒测序结果表明成功构建pcDNA3.1-X。2、瞬时转染后SUDHL-4细胞有HBx mRNA的表达,与SUDHL-4组细胞及SUDHL-4-con组细胞相比,SUDHL-4-HBx细胞的增殖减缓,G0/G1期细胞比例增加、S期细胞所占比例减少,细胞凋亡率增加。3、稳定转染HBx基因的SUDHL-4细胞有HBx mRNA及HBx蛋白的表达,与SUDHL-4和SUDHL-4-con组细胞相比,SUDHL-4-HBx细胞的增殖能力、粘附力及转移侵袭能力有不同程度增强;细胞周期无显著变化,细胞凋亡率显著降低。结论:1、成功构建整合有HBV X基因和蛋白的B-NHL细胞株SUDHL-4-HBx。2、瞬时转染HBx基因后,SUDHL-4-HBx细胞的增殖减缓,细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率增加。3、稳定转染HBx基因后,SUDHL-4-HBx细胞的增殖能力及粘附力、侵袭转移能力均显著增强;细胞凋亡率显著降低。