目的:强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种与免疫因素相关的脊柱关节病变,主要发生于脊柱、骶髂关节和髋关节,导致伴随炎性疼痛的脊柱骨性强直乃至脊椎关节融合、骶髂关节和髋关节的退行性病变等。另外,AS常常伴随活动性关节炎、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、银屑病关节炎和急性葡萄膜炎。AS发展到中晚期,可引起脊椎骨性融合从而形成“竹节样”脊柱,使脊柱活动功能受限,具有较高的致残率。因此,研究AS的发病机制和有效的防治药物具有重要意义。AS病因复杂,涉及中轴关节、软骨、肌腱和韧带的改变。其中,脊柱韧带骨化引起的异位骨形成是AS关键病理进程,但韧带骨化的机制尚不清楚。前期研究发现AS患者棘上韧带中转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1,TGF-β1)、骨形成蛋白2(bone morphogenetic proteins,BMP2)和TGF-β受体3(transforming growth factor-βreceptor 3,TGFβR3)表达较对照韧带明显升高。在预实验中,我们也发现从AS脊柱棘上韧带成纤维细胞可诱导成骨分化,提示其参与AS韧带骨化。与韧带结果一致的是,AS成纤维细胞的TGF-β1、BMP2和TGFβR3表达也显著高于对照成纤维细胞。TGF-β1和BMP2同属TGF超家族成员,均可被TGFβR3受体识别而活化下游Smad通路,而后者是诱导成骨分化的关键通路之一。由于TGF-β1和BMP2均具有成骨诱导作用,二者可能通过作用于TGFβR3-Smad通路参与AS成纤维细胞成骨分化,但该设想尚需验证。基于上述研究基础,我们提出“TGFβR3过表达介导AS原代成纤维细胞成骨分化”的假设。本研究拟围绕TGFβR3开展工作,首先明确TGF-β1和BMP2通过过表达的TGFβR3诱导AS原代成纤维细胞成骨分化,然后确认TGFβR3-Smad通路中介导AS成纤维细胞成骨分化的关键分子,以初步阐明AS成纤维细胞成骨分化的分子机制,为研究治疗AS的靶向药物或其它治疗措施提供候选靶点。方法:一、TGFβR3在AS临床标本中的表达(一)采用苏木素-伊红(HE)染色法对AS棘上韧带和普通棘上韧带的石蜡组织切片进行染色,观察AS患者棘上韧带的病理改变;(二)采用免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)对AS棘上韧带和普通棘上韧带(对照)的石蜡组织切片中的TGFβR3、TGF-β1和BMP2进行特异性染色,观察AS患者棘上韧带中的相关蛋白表达较对照是否发生改变;(三)采用实时荧光-聚合酶链式反应(real-time PCR)对AS棘上韧带和普通棘上韧带中TGFβR3、TGF-β1和BMP2表达进行检测,观察其在AS患者棘上韧带中的基因表达较对照是否发生改变;(四)采用免疫印迹法(western blot,WB)对AS棘上韧带和普通棘上韧带中TGFβR3、转化生长因子β1和BMP2的蛋白表达进行检测,观察其在AS患者棘上韧带中的蛋白表达较对照是否发生改变;(五)采用组织块培养法从AS棘上韧带和普通棘上韧带中分离培养人原代棘上韧带成纤维细胞(human supraspinous ligament fibroblasts,HSLFs),用于观察细胞中蛋白表达或后续成骨诱导实验;(六)采用免疫荧光法(immunofluorescence,IF)检测AS来源HSLFs细胞和普通HSLFs细胞(对照)中TGFβR3、TGF-β1和BMP2的蛋白表达,观察其在AS来源HSLFs细胞中的蛋白表达较对照是否发生改变;二、确认TGFβR3介导AS成纤维细胞成骨分化作用(一)AS原代成纤维细胞的成骨分化检测采用矿化诱导-茜素红染色法对HSLFs细胞进行钙化诱导和钙化结节染色,观察AS来源HSLFs细胞较对照细胞是否产生更多细胞外钙化结节;(二)TGF-β1联合BMP2对TGFβR3过表达HSLFs细胞成骨分化的影响1.构建TGFβR3过表达载体pc DNA-TGFβR3,并进行酶切检测和测序验证;2.采用脂质体法转染过表达载体到普通HSLFs细胞中,构建特异性过表达TGFβR3的HSLFs细胞;3.采用western blot检测TGFβR3过表达情况;4.观察TGF-β1联合BMP2对TGFβR3过表达的HSLFs细胞成骨分化的影响:(1)采用鬼笔环肽染色法标记TGFβR3过表达的HSLFs细胞细胞骨架,以观察TGF-β1联合BMP2对细胞面积的影响;(2)采用细胞计数法观察TGF-β1联合BMP2对TGFβR3过表达的HSLFs细胞增殖的影响;(3)采用矿化诱导-茜素红染色法对TGFβR3过表达HSLFs细胞进行钙化诱导和钙化结节染色,以观察TGF-β1联合BMP2是否诱导其成骨分化;(4)采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)显色法检测TGFβR3过表达HSLFs细胞总蛋白中ALP活性,以观察TGF-β1联合BMP2是否诱导其成骨分化;(三)TGF-β1联合BMP2对TGFβR3低表达的HSLFs细胞成骨分化的影响1.采用脂质体法转染TGFβR3的si RNA到TGFβR3过表达HSLFs细胞中,构建TGFβR3低表达HSLFs细胞;2.采用半定量PCR检测si RNA封闭TGFβR3表达的效率;3.TGF-β1联合BMP2对TGFβR3低表达的HSLFs细胞成骨分化的影响:(1)采用鬼笔环肽染色法标记TGFβR3低表达的HSLFs细胞骨架,以观察TGF-β1联合BMP2对细胞面积的影响;(2)采用矿化诱导-茜素红染色法对TGFβR3低表达HSLFs细胞进行钙化诱导和钙化结节染色,以观察TGF-β1联合BMP2是否诱导其成骨分化;(3)采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)显色法检测TGFβR3低表达HSLFs细胞总蛋白中ALP活性,以观察TGF-β1联合BMP2是否诱导其成骨分化;三、确认AS成纤维细胞成骨分化中TGFβR3/Smad通路关键分子(一)TGF-β1联合BMP2对TGFβR3过表达HSLFs细胞Smad通路的影响:Western blot检测TGF-β1联合BMP2对TGFβR3过表达HSLFs细胞TGFβR1、TGFβR2、TGFβR3、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad1、p-Smad1、Smad4和RUNX2表达的影响;(二)TGF-β1联合BMP2对TGFβR3低表达HSLFs细胞Smad通路的影响:Western blot检测TGF-β1联合BMP2对TGFβR3低表达HSLFs细胞TGFβR1、TGFβR2、TGFβR3、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad1、p-Smad1、Smad4和RUNX2表达的影响;四、确认TGFβR3/Smad通路关键分子在AS临床标本中的表达(一)AS棘上韧带中p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2的表达采用IHC检测p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2在AS棘上韧带中的表达较骨折来源棘上韧带是否上调;(二)AS来源HSLFs细胞中p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2的表达采用免疫荧光检测p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2在AS来源HSLFs细胞中的表达较普通HSLFs细胞是否上调。结果:一、TGFβR3在AS临床标本中的表达(一)AS临床标本的组织病理学鉴定AS患者脊柱和骶髂关节融合;而AS棘上韧带组织与正常棘上韧带相比,纤维束断裂、排列紊乱、玻璃样变性,脂肪浸润和血管增生较多。(二)TGFβR3在AS临床标本中的表达1.AS棘上韧带组织TGFβR3、TGF-β1和BMP2蛋白表达均显著高于正常棘上韧带组织,其表达多分布于血管周围、纤维化部位及韧带外包膜;2.TGFβR3在AS标本中m RNA表达量约为对照组的5~6倍,TGF-β1在AS标本中的m RNA表达量约为对照组的2倍,BMP2在AS标本中的m RNA表达量比对照组高100~150倍;3.Western blot检测也表明在AS棘上韧带中TGFβR3、TGF-β1和BMP2蛋白表达均高于对照棘上韧带。(三)TGFβR3在AS原代成纤维细胞中的表达1.成功从AS棘上韧带和骨折棘上韧带分离培养获得原代成纤维细胞(h SLFs);2.AS来源h SLFs细胞中TGF-β1、BMP2及TGFβR3的蛋白表达较普通h SLFs细胞明显增高,与在棘上韧带的RNA水平和蛋白水平检测结果一致。二、确认TGFβR3介导AS成纤维细胞成骨分化作用(一)AS原代成纤维细胞的成骨分化检测成骨诱导AS来源HSLFs细胞后细胞外钙化结节较普通HSLFs细胞明显增多。(二)TGF-β1联合BMP2对TGFβR3过表达的HSLFs细胞成骨分化的影响1.pc DNA-TGFβR3质粒构建成功;2.构建的TGFβR3过表达HSLFs细胞的TGFβR3表达显著高于普通HSLFs细胞;3.TGF-β1联合BMP2诱导TGFβR3过表达HSLFs细胞的细胞面积明显增大;4.TGF-β1联合BMP2对TGFβR3过表达HSLFs细胞增殖无明显影响;5.TGF-β1联合BMP2可诱导TGFβR3过表达HSLFs细胞的钙化结节较单用TGF-β1或BMP2明显增多;6.TGF-β1联合BMP2可诱导TGFβR3过表达HSLFs细胞ALP活性较单用TGF-β1或BMP2明显增强。(三)TGF-β1联合BMP2对TGFβR3低表达的HSLFs细胞成骨分化的影响1.转染TGFβR3 si RNA的HSLFs细胞中TGFβR3表达仅为转染无关si RNA的细胞的30%;2.TGF-β1联合BMP2较单用组不能进一步诱导TGFβR3低表达HSLFs细胞肥大;3.TGF-β1联合BMP2较单用组不能进一步诱导TGFβR3低表达HSLFs细胞的钙化结节;4.TGF-β1联合BMP2较单用组不能进一步诱导TGFβR3低表达HSLFs细胞的ALP活性升高。三、确认AS成纤维细胞成骨分化中TGFβR3/Smad通路关键分子(一)TGF-β1联合BMP2对TGFβR3过表达HSLFs细胞Smad通路的影响1.TGF-β1联合BMP2较单用组显著上调TGFβR3表达,但不能进一步上调TGFβR1和TGFβR2表达;2.TGF-β1联合BMP2较单用组显著上调Smad2/3和Smad1磷酸化、Smad4和RUNX2表达。(二)TGF-β1联合BMP2对TGFβR3低表达HSLFs细胞Smad通路的影响1.TGF-β1联合BMP2较单用组不能进一步上调TGFβR3低表达HSLFs细胞的TGFβR3表达,表明在TGFβR3低表达情况下TGF-β1联合BMP2的协同效应消失;2.TGF-β1联合BMP2较单用组不能进一步上调TGFβR3低表达HSLFs细胞的Smad2/3和Smad1磷酸化水平,协同效应丧失;TGF-β1联合BMP2进一步下调TGFβR3低表达HSLFs细胞的Smad4和RUNX2表达,其在TGFβR3高表达HSLFs细胞中的协同效应翻转为拮抗效应。四、确认TGFβR3/Smad通路关键分子在AS临床标本中的表达(一)AS棘上韧带中p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2的表达AS棘上韧带组织的p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2蛋白表达较正常棘上韧带组织显著上调,其表达多分布于血管周围、纤维化部位及韧带外包膜。(二)AS来源HSLFs细胞中p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2的表达AS来源HSLFs细胞的p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2蛋白表达较普通HSLFs细胞均明显增高,与在完整棘上韧带组织的IHC检测结果一致。结论:1.AS棘上韧带较正常棘上韧带发生显著组织病理改变;2.TGFβR3、TGF-β1和BMP2在AS棘上韧带组织中的表达较对照组织显著升高,在AS原代成纤维细胞中的表达较对照细胞也显著升高;3.AS原代成纤维细胞可自动成骨分化;4.TGF-β1联合BMP2可诱导TGFβR3过表达HSLFs细胞成骨分化,二者具有协同效应;5.封闭TGFβR3表达后,TGF-β1联合BMP2诱导HSLFs细胞成骨分化作用丧失,提示TGF-β1协同BMP2诱导成骨分化作用依赖于TGFβR3的过表达;6.TGF-β1联合BMP2较单用组显著上调TGFβR3表达、下游效应分子Smad2/3和Smad1磷酸化、Smad4和RUNX2的表达;7.封闭TGFβR3表达后,TGF-β1联合BMP2上调TGFβR3表达、下游效应分子Smad2/3和Smad1磷酸化、Smad4和RUNX2表达的作用丧失,提示TGF-β1协同BMP2诱导TGFβR3-Smad通路活化作用依赖于TGFβR3的过表达;8.TGFβR3-Smad通路效应分子p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2的表达在AS棘上韧带组织和AS原代成纤维细胞中均显著升高;9.本研究明确TGF-β1和BMP2经由过表达的TGFβR3诱导AS棘上韧带来源的成纤维细胞成骨分化,其分子机制为通过激活p-Smad2/3和p-Smad1磷酸化、Smad4表达,同时活化TGF-β/Smad和BMP/Smad通路,上调成骨诱导因子RUNX2表达而发挥作用。