目的①探讨加速转轮试验、改良贴纸移除试验、改良神经功能缺损程度评分(mNSS)等定量检测方法及体重指数在评价大脑中动脉闭塞(MCAO)模型大鼠脑梗死范围、反映脑梗死后神经功能缺损动态变化及评价疗效时的应用价值。②用筛选出的定量检测方法(加速转轮试验和改良贴纸移除试验)对大脑中动脉闭塞(MCAO)模型大鼠脑内移植5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记的骨髓基质细胞(BMSCs)治疗后13天内的神经功能进行动态测评,测量计算间接梗死面积,行BrdU、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色,观察植入梗死灶内不同区域的BMSCs的存活、迁移情况以及植入细胞的行为与脑内微环境中GFAP阳性细胞的形态关系。③建立一种稳定高的、死亡率低、操作相对简单的小鼠脑局灶性缺血模型,并探讨改良神经功能缺损程度评分(mNSS)对这一模型中神经功能评价的应用价值。材料与方法①实验性脑梗死大鼠神经功能的定量、动态测评:31只7-9周龄SD大鼠采用随机数字表法分为MCAO造模组(n=26)和假手术组(n=5),采用线栓法制作MCAO(1h)模型,假手术组大鼠不置入线栓。在MCAO造模手术/假手术前及术后第1、3、5、7、10、14天应用加速转轮试验、改良贴纸去除试验和mNSS检测神经功能缺损情况,并记录体重指数反映其全面健康状况。MCAO造模后第14d处死大鼠,取脑切片,测量梗死病变面积(间接法)。根据梗死病灶累及的范围,将实验大鼠分为无病变组、基底节梗死组和皮层+基底节梗死组,对不同梗死范围的大鼠在各时间点重复测量的结果进行比较(重复测量数据的方差分析);采用单向方差分析(one way ANOVA)比较各检测时间点上3组大鼠的神经功能功能检测结果以及各病变病变范围大鼠组内各时间点检测结果间的差异;以Spearman相关系数分析MCAO造模术后1天各项神经功能检测结果与病变面积与之间的相关关系。②46只7-9周龄SD大鼠采用随机数字表法分BMSCs移植组(n=25)、和PBS对照组(n=21),均采用线栓法制作MCAO(1h)模型,BMSCs移植组大鼠在造模24h后向病变侧纹状体区注射BrdU标记的同种异体BMSCs2×10~6个,PBS对照组注射等量PBS。在MCAO造模手术/假手术前及MCAO后第1(移植术前)、3、5、7、10、14天应用加速转轮试验、改良贴纸去除试验,MCAO后14天处死大鼠,取脑切片,测量间接梗死面积,行BrdU和GFAP免疫组化染色观察BMSC在不同区域和不同胶质细胞环境下的存活和迁移情况。以实验第1部分中造模成功的大鼠为MCAO对照组,应用SPSS13.0统计软件,采用重复测量数据方差分析对MCAO对照组、PBS对照组和BMSCs移植组大鼠在各时间点的加速转轮试验和改良贴纸移除试验结果进行比较,采用one way ANOVA对不同检测时间点上3组大鼠的运动及感觉功能检测结果、3组大鼠组内各时间点间检测结果差异以及3组的梗死面积,并根据缺血范围对神经功能检测结果进行亚组分析。③应用SPF级成年雄性NIH小鼠55只,随机分为插管注胶法脑缺血造模组(n=49)及对照组(n=6),其中脑缺血造模组又根据注胶后注射管的处理分为拔管组(n=26)和剪管组(n=23),采用经颈总动脉插管注射α-氰基丙烯酸正丁酯(NBCA)的方法制作小鼠局灶性脑缺血模型,拔管组和剪管组在注胶后将注射管拔出或剪断,对照组注入等量的碘化油。由两名检测者应用改良神经功能缺损程度评分(mNSS)分别对其神经功能进行测评,脑缺血造模后24小时将小鼠处死取脑,行2,3,5三苯基四氮唑(TTC)染色,用ImageTool图像分析软件测量计算梗死体积。统计造模成功率、死亡率及死亡原因,独立样本T检验比较拔管组和剪管组梗死灶分布范围及各层面梗死面积、梗死体积、脑水肿指数,采用两独立样本非参数检验比较两种手术方法造成的梗死灶的范围和mNSS结果,Kappa吻合系数分析不同检测者所做的神经功能缺损评分的一致性,对梗死灶体积和mNSS结果做相关分析。结果①据梗死面积,线栓法大脑中动脉梗死造模后的大鼠可分为3组:无病变组(n=3);基底节梗死组(n=10),间接梗死面积16.97%±12.01%;皮层+基底节梗死组(n=13),间接梗死面积69.79%±10.49%;经重复测量资料方差分析,3组间的加速转轮试验(F=9.391,P=0.001)、改良贴纸去除试验(F=17.172,P=0.000)、mNSS评分(F=12.008,P=0.000)和体重指数(F=7.501,P=0.000)结果差异均有统计学意义,经过对不同时间点上三组间各检测项目结果和各组内不同时间点检测结果间的单向方差分析(one way ANOVA),以及多重分析,结果显示大鼠实验性脑梗死后第1天的加速转轮试验结果在不同病变范围的大鼠间差异有显著意义,表明在MCAO后第1天加速转轮试验可用于预测梗死病变的范围,在基底节梗死组和皮层+基底节梗死组大鼠,缺血后14天内加速转轮试验成绩均无恢复,提示加速转轮试验可用于缺血后14天内的疗效评价;改良贴纸移除试验可在脑缺血后14天内敏感地反映MCAO后大鼠的感觉功能损害,可用于病变严重程度的分层及疗效评价;脑缺血后1天的mNSS可用于梗死严重程度的分层,但mNSS对MCAO后较长时间的神经功能缺损敏感性不高;体重指数可反映脑梗死范围对大鼠全面健康状况的影响,但对脑缺血后14天内的神经功能缺损敏感性不高。经Spearman相关分析,梗死面积与脑缺血后1天的4项神经功能检测结果之间的相关关系有统计学意义(P＜0.05),其中梗死面积与脑缺血后1天的加速转轮试验、改良贴纸移除试验及mNSS结果相关关系密切(Spearman相关系数分别为-0.791、0.755和0.700),而与脑缺血造模术后1天的体重指数无密切相关关系(Spearman相关系数为-0.446)。②MCAO对照组、PBS对照组与BMSCs移植组大鼠的脑梗死面积无显著性差异(F=1.049,P=0.357);重复测量数据方差分析显示3组大鼠的加速转轮试验结果之间差异有显著意义(F=4.907,P=0.012),BMSC移植组在加速转轮上的停留时间长于两个对照组;One way ANOVA分析显示术后第7、10、14天3组之间的加速转轮试验结果差异有显著意义(P＜0.05),在基底节梗死亚组中,术后第7天及第10天BMSCs移植组的加速转轮试验结果与MCAO对照组、PBS对照组差异均有显著意义(P＜0.05),而两个对照组之间结果差异无统计学意义(P＞0.05),BMSCs移植组的加速转轮试验结果优于两个对照组;贴纸移除试验各组内不同时间点的检测结果比较显示:BMSCs移植组MCAO后第14天的检测结果与术后第1、3天结果有显著性差异(P值分别为0.018、0.009),术后14天移除贴纸所需时间缩短,而两个对照组内MCAO后各时间点的贴纸移除试验结果无显著性差异(P＞0.05);在基底节+皮层梗死亚组中,BMSCs移植组与两个对照组移除贴纸所需时间的差异在第10天和第14天均有显著意义(P＜0.005),而两个对照组间结果无显著性差异(P＞0.05),BMSCs移植组移除贴纸所需时间短于两个对照组;组织学观察发现植入缺血半暗带区的细胞存活细胞数量最多,且向病变方向放射状迁移,植入缺血病灶核心的细胞甚少存活,且无迁移现象,植入正常灰质中的BMSCs向四周呈放射状迁移,移植入正常白质中的BMSCs沿白质纤维方向迁移。BrdU阳性的植入细胞多与GFAP阳性细胞共存并在其间迁移,致密的胶质瘢痕成为阻挡BrdU阳性细胞迁移的屏障,在GFAP阳性细胞极少存活的缺血坏死中心,植入的BMSCs极少存活和迁移。③接受插管注胶造模手术的49只小鼠中有40只顺利完成手术,假手术组6只小鼠均顺利完成手术,术中死亡率12.7%,完成手术的脑缺血造模组小鼠总造模成功率为85%,其中拔管组成功率75%,剪管组成功率100%,按脑血管供血区域,将梗死灶范围分为:A.无病灶,B.大脑中动脉基底节区,C.大脑中动脉基底节区+皮层,D.大脑中动脉+大脑后动脉分布区(MCA+PCA),E.大脑中动脉+大脑前动脉分布区(MCA+ACA)和F.大脑中动脉+大脑前动脉+大脑后动脉分布区(MCA+PCA+ACA)。拔管组和剪管组所造成的小鼠脑梗死灶体积分别为101.677±81.313mm~3和149.746±67.254mm~3,梗死灶体积(P=0.086)及水肿指数(P=0.288)无统计学显著性差异;拔管组和剪管组小鼠脑梗死病灶的范围无显著性差异(P=0.881);两组的mNSS评分差异有统计学意义(Mann-WhitneyU=-2.739,P=0.037),剪管组神经功能缺损程度重于拔管组。拔管组和剪管组的梗死体积变异系数分别为0.800和0.449,剪管组的梗死体积的稳定性高于拔管组。两名检测者对脑缺血后小鼠神经评分结果有较高的一致性(P=0.000,Kappa=0.84-1.000),mNSS结果与病灶体积间呈密切的相关关系(P=0.000,Spearman’s相关系数为0.888)。结论①线栓法大脑中动脉缺血模型所制造的梗死面积重复性不佳,但是此模型所制作的梗死范围并非随机分布,而是可以分为基底节梗死(占最大病变切面半球面积的16.97%±12.01%)和皮层+基底节梗死(占最大病变切面半球面积69.79%±10.49%)这两组。②神经功能定量检测指标(加速转轮试验、改良贴纸移除试验和mNSS)可以可靠地评价和预测大鼠大脑中动脉线栓模型的梗死严重程度,可用于实验性脑梗死治疗研究中样本的分层。③加速转轮试验和改良贴纸移除试验在MCAO后14天内可敏感地反映大鼠的神经功能缺损,可反映缺血后较长时间的神经功能缺损和用于疗效评价;mNSS可用于脑缺血后1天的梗死严重程度分层,但对MCAO后较长时间的神经功能缺损敏感性不高;体重指数对脑缺血后14天内的神经功能缺损敏感性不高。④在脑缺血后24小时,向缺血侧脑组织内注射未经诱导分化处理的BMSCs未能使梗死范围减小,但经MCAO后1,3,5,7,10,14天的加速转轮试验和改良贴纸移除试验检测分析,BMSCs脑内移植可以促进实验性脑梗死大鼠运动和感觉功能的恢复。⑤植入脑梗死组织不同部位的骨髓基质细胞有不同的存活和迁移行为,位于坏死核心部位的BMSCs存活量甚少,形成孤立的小细胞团,无迁移行为;植入缺血半暗带区及半暗带与正常组织交界区的骨髓基质细胞则表现出朝向缺血区方向为主的迁移行为。⑥增生活化的GFAP阳性细胞之间的间隙中有BrdU阳性细胞迁移的“通道”,而在有胶质瘢痕形成的部位,BMSC的迁移受到阻挡,在脑缺血后几乎无星形胶质细胞残留的区域,仅有个别的BMSCs存活,且没有迁移行为。⑦本研究首创了插管注胶法小鼠局灶性脑缺血模型,此模型利用介入治疗用粘附性液体栓塞剂NBCA的理化特性,将微导管插入颈内动脉颅外段后,将一定浓度、剂量的NBCA以一定速度注入,达到阻断脑内供血的目的,插管注胶模型造成大脑中动脉区缺血的成功率达85%,若注胶后不拔管,成功率达到100%。⑧新的造模方法避免了传统线栓模型操作过程中最易导致血管损伤的两个步骤,达到避免蛛网膜下腔出血、降低术中死亡率的目的,同时简化了操作过程,值得在小鼠脑缺血实验研究中推广应用。⑨拔管组和剪管组所造成的小鼠脑梗死灶体积和梗死范围无统计学显著性差异,两组的神经功能缺损评分差异有统计学意义,剪管组梗死体积稳定性高于拔管组,神经功能缺损程度也较拔管组更重。⑩本研究中改良的小鼠神经功能缺损评分(mNSS)具有较高的客观性、可重复性,不同检测者对6个项目的评分结果经Kappa一致性检验显示高度的一致性。mNSS评分与梗死灶体积之间统计学显著意义的、密切的相关关系,mNSS可以有效地评价小鼠脑梗死导致的神经功能改变。