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细菌性果斑病（Bacterial Fruit Blotch,BFB）是一种严重危害葫芦科植物的种传细菌性病害,其病原菌为西瓜食酸菌（Acidovorax citrulli）。该病害自爆发以来,在世界各地迅速传播,使得葫芦科作物受到巨大的损失。目前,使用含铜制剂是大田防控BFB的主要措施,但是铜的过量使用不仅会导致土壤污染,同时还发现了西瓜食酸菌抗铜菌株的出现。因此,探究该病菌的抗铜机制,可以为研究开发有效防控BFB的新方法、新措施提供理论依据。基于此,本研究通过对西瓜食酸菌FC440菌株的Tn5转座子插入突变体库的筛选,获得两个抗铜能力改变的突变体。利用生物信息学分析、基因功能互补等手段,鉴定出2个与西瓜食酸菌抗铜机制相关的基因,并且对基因的功能进行了验证。主要结果如下:本研究首先比较了西瓜食酸菌基因功能研究中常用的表达载体p BBR1MCS-5和p HC60对菌的生物学特性的影响。实验结果表明:表达载体p BBR1MCS-5对菌株的胞外纤维素酶活性、胞外蛋白酶活性、胞外多糖含量、游动性、致病性和诱导过敏性坏死反应能力、生长速率以及抗铜性等方面未表现出显著影响,而表达载体p HC60会显著抑制宿主菌株的生长速率和游动性。由此说明,表达载体本身会影响西瓜食酸菌的某些生物学特性,在基因功能研究中应依据所研究基因的功能选择适宜的表达载体。本研究中基因功能分析表达载体选用p BBR1MCS-5。本研究筛选西瓜食酸菌FC440菌株的Tn5转座子插入突变体库,获得2株抗铜能力减弱的突变体。利用质粒挽救法获得这2株突变体的突变位点分别与西瓜食酸菌AAC00-1菌株的Aave-1811和Aave-2798基因同源;生物信息学分析显示,基因Aave-1811和Aave-2798分别编码TolC外膜蛋白和GntR家族转录调控因子。本研究比较发现西瓜食酸菌AAC00-1、FC440、XJL12和AW0601四个菌株的tolC基因的大小相同均为1488 bp,但核酸序列存在差异,其中FC440菌株的与AW0601菌株的一致,AAC00-1菌株的与XJL12菌株的一致。结构预测分析表明,TolC蛋白可以分泌大小为18～19氨基酸的信号肽,该蛋白在20～30氨基酸处疏水性较高,存在一个跨膜区,亚细胞定位于周质空间。以TolC蛋白为标记的进化树分析显示,西瓜食酸菌与燕麦食酸菌（Acidovorax avenae）的亲缘关系较近;大肠杆菌（Escherichia coli）和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的亲缘关系较近。突变体FC440（?tolC）菌株在含3.75 mmol/L Cu SO4的KMB培养基上已失去生长能力,其基因功能互补菌株在含3.75 mmol/L Cu SO4的KMB培养基中生长能力部分恢复,证明TolC蛋白参与了西瓜食酸菌的抗铜机制;基因tolC的突变未影响西瓜食酸菌除抗铜性外的其它生物学特性,说明TolC未参与到该菌的这些生理活动中。西瓜食酸菌FC440菌株的GntR家族转录调控因子的基因全长为1041 bp。蛋白序列分析显示不产生信号肽,在185～195氨基酸处疏水性较高,存在一段跨膜结构域,理化性质的分析表明该蛋白为不稳定蛋白质,亚细胞定位在细胞质中。进化树分析显示,西瓜食酸菌GntR家族转录调控因子与根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的亲缘关系较近,与大肠杆菌的亲缘关系较远。突变体FC440（?gnt R）菌株在含3.75 mmol/L Cu SO4的KMB培养基中生长能力减弱,其基因功能互补菌株在含5.625 mmol/L Cu SO4培养基中生长能力完全恢复,证明GntR家族转录调控因子对西瓜食酸菌的抗铜性有贡献;gnt R基因突变未影响菌的除抗铜能力外的其它生物学特性,说明GntR家族转录调控因子与菌的这些生理活动无显著相关性。本研究结果表明西瓜食酸菌中的TolC和GntR蛋白参与了该菌的抗铜机制。