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研究背景瘢痕疙瘩是以成纤维细胞异常增殖并分泌大量细胞外基质(extracellular matrix,ECM)为主要特征的皮肤纤维化疾病,治疗效果不佳,发病机制尚不清楚。二聚糖(Biglycan,BGN)又称为双糖链蛋白聚糖,是一种属于糖蛋白类的蛋白质,由核心蛋白(core protein)和两个硫酸软骨素/硫酸皮肤素(chondroitin sulfate,CS/dermatan sulfate,DS)糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)链组成,在皮肤组织结构合成、空间填充和皮肤生理功能中起到重要作用。BGN虽然在许多组织中大量的表达,但其生物功能仍然知之甚少。靶向敲除BGN基因可观察到异常胶原纤维形态和骨质疏松症样表型。BGN通过其核心蛋白和GAG侧链共同作用下参与合成ECM。瘢痕疙瘩具有细胞增殖旺盛和持续浸润生长等肿瘤特征。近年来研究发现BGN在多种肿瘤中的表达升高,并具有促进肿瘤细胞增殖和转移的作用,被认为是肿瘤治疗的潜在靶点。所以,我们推测BGN活性增加可能与瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和分泌大量ECM密切相关。BGN在瘢痕疙瘩中的表达以及能否作为治疗靶点尚未见报道。第一部分研究目的:明确BGN在瘢痕疙瘩组织和成纤维细胞中的表达,阐明瘢痕疙瘩新的发病机制。方法:采用HE染色法比较瘢痕疙瘩和瘢痕疙瘩旁正常皮肤组织结构及胶原纤维构成的差异;免疫组化染色法比较BGN和ECM相关蛋白的表达;采用Western blot法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞的BGN和ECM相关蛋白的表达。结果:组织学观察发现瘢痕疙瘩组织内有大量细胞外基质的堆积,细胞密度明显增加;在瘢痕疙瘩组织内BGN、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达明显增多,瘢痕疙瘩成纤维细胞内和外液中BGN、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达均比正常皮肤成纤维细胞增多。结论:BGN在瘢痕疙瘩组织和成纤维细胞内和外液中表达增高。第二部分研究目的:探讨敲减BGN在瘢痕疙瘩成纤维细胞中胶原合成及相关信号通路蛋白磷酸化水平的影响。观察敲减BGN对瘢痕疙瘩成纤维细胞移行能力的影响,进一步证实其抗瘢痕疙瘩迁移作用。方法:首先采用siRNA的方法对瘢痕疙瘩成纤维细胞内和外液中的BGN进行了敲减,成功敲减BGN之后,用Western blot方法检测细胞外基质蛋白表达的改变和相关信号通路蛋白磷酸化水平的影响。利用体外细胞划痕实验方法观察瘢痕疙瘩成纤维细胞的移行能力。结果:在瘢痕疙瘩成纤维细胞内和外液中,敲减BGN后明显抑制了 ECM相关蛋白Ⅰ型前胶原(Pro-collagen Ⅰ)和Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ)的表达,且发现在BGN敲减后,明显抑制了瘢痕疙瘩成纤维细胞中Akt和ERK磷酸化水平。敲减BGN显著抑制了瘢痕疙瘩成纤维细胞的移行能力。结论:敲减BGN不仅可以有效抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞内和外液中胶原的合成,还可以抑制Akt和ERK磷酸化水平,而且明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的移行,表明敲减BGN有明显的抗瘢痕疙瘩迁移作用。第三部分研究目的:探讨在瘢痕疙瘩成纤维细胞内和外液中,敲减BGN对转化生长因子β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)促进细胞外基质分泌作用的影响及对TGF-β1诱导的信号通路相关蛋白的磷酸化水平影响。方法:采用含10 ng/ml浓度的TGF-β1的培养基培养瘢痕疙瘩成纤维细胞,分别在培养0、0.5、1、3、6、12、24、48、72 h后,在蛋白水平上检测瘢痕疙瘩成纤维细胞的BGN、Pro-collagenⅠ、collagenⅢ及信号通路相关蛋白表达。同时在TGF-β1培养条件下敲减BGN,Western blot检测ECM分泌情况及信号通路相关蛋白的磷酸化水平的影响。结果:Western blot检测:瘢痕疙瘩成纤维细胞内和细胞外液在TGF-β1处理24 h之后BGN的表达开始升高。在瘢痕疙瘩成纤维细胞内Pro-collagen Ⅰ在TGF-β1处理24 h开始逐渐升高,至72 h达最高峰;在细胞外液中48 h之后才开始升高。细胞内collagen Ⅲ在TGF-β1处理3 h后升高,之后逐渐下降24 h又达到另一个高峰,48 h开始趋势下降;在细胞外液中TGF-β1处理24 h后开始逐渐升高,至72 h达高峰。瘢痕疙瘩成纤维细胞中p-Akt(Thr308)在TGF-β1处理0.5 h和1 h后明显升高,之后逐渐下调,24 h开始又逐渐升高,至72 h达高峰,p-ERK在TGF-β1处理1 h明显升高,之后逐渐下降,12 h开始出现逐渐升高趋势,到48 h时达到另一个高峰。在TGF-β1培养条件下,敲减BGN可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞Pro-collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白的表达,同时也抑制Akt和ERK的磷酸化水平。结论:TGF-β1培养条件下,敲减BGN可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞内和外液中Pro-collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表达,且有效抑制Akt和ERK的磷酸化水平。BGN可能通过调控细胞外基质表达,且通过TGF-β1介导的Akt、ERK信号通路来参与了瘢痕疙瘩形成,并可以作为瘢痕疙瘩治疗靶点。