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第一部分IKBKB点突变小鼠的建立及对免疫学表型和中性粒细胞的影响
目的：课题组前期收治一例来自近亲婚配家庭的IKBKBc.1183T>C,p.Y395H基因突变患儿，临床表现为自幼反复感染、慢性腹泻、生长发育落后的联合免疫缺陷病(CID)；其外周血T、B细胞数量正常但功能受损。与以往确诊的IKBKB缺陷病例不同的是，该患儿病情较轻，生存期(造血干细胞移植前已经18岁)明显长于全球确诊的其他患儿，因而我们确认其为病情较轻的CID，其原因可能主要是具有不同性质的基因突变。NF-кB通路广泛参与多种免疫细胞功能发挥，其活化通路中的重要分子——IKBKB发挥着不可替代的作用。遗憾的是，IKBKB基因全敲小鼠胚胎致死，无法用于研究其变异对通路和各种免疫细胞功能研究，而Y395H定点纯合突变小鼠也许可以提供一个IKBKB敲低的可靠模型。因此，本研究拟通过CRISPR/Cas9技术构建同源位点突变小鼠，采用基因测序、Real-timePCR及Westernblot验证模型，对突变蛋白进行建模，并对其免疫学表型及中性粒细胞功能进行初步探讨，期望为深入研究该位点突变对免疫学功能的影响奠定基础，并为疾病的发病机制提供固有免疫证据。
方法：采用CRISPR/Cas9技术构建相应点突变模式小鼠，并提取小鼠基因组DNA进行PCR及一代测序、鉴定及扩繁，提取小鼠脾脏及胸腺淋巴细胞,采用Real-timePCR及Westernblot检测淋巴细胞中IKKs家族各亚基(IKKα、IKKβ和IKKγ)mRNA及蛋白的表达，并使用分子运行模式(MOE，Molecular Operating Environment)软件分析IKKβ蛋白PDB结构并建立3D模型。使用流式细胞术检验小鼠脾脏中Treg细胞比例；同时提取小鼠骨髓中性粒细胞，采用鲁米诺化学发光发检测中性粒细胞NADPH途径活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)及中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophils Extracellular Traps, NETs)水平变化。
结果：小鼠基因测序及Westernblot结果表明成功构建点突变稳定基因型小鼠，在脾脏和胸腺淋巴细胞中，与野生型小鼠相比,纯合突变小鼠IKBKBmRNA表达无明显变化,而IKKβ蛋白表达明显降低，用分子运行模式(molecular operating environment, MOE)软件分析蛋白PDB结构提示突变后的IKKβ蛋白其空间构型明显改变。分析表型发现脾脏Treg细胞比例也降低。对于小鼠骨髓成熟粒细胞，与野生型小鼠相比，突变型小鼠中性粒细胞胞外ROS没有统计学差异，但对于胞内ROS，突变型小鼠的呼吸爆发峰值降低。且突变型小鼠NETs基础值较野生型明显偏低，经PMA刺激后NETs变化趋势与野生型小鼠相比也较低。
结论：该研究初步表明IKBKBY397H突变导致小鼠脾脏及胸腺的淋巴细胞中IKKβ蛋白明显降低，Treg细胞比例下降以及骨髓中性粒细胞胞内途径呼吸爆发水平减少，且其释放NETs初始杀菌功能较正常对照降低，可能与突变导致蛋白结构发生改变而使其稳定性减低，影响免疫细胞的分化、发育和功能行使有关，但具体机制目前尚不清楚。本研究为进一步探究该位点突变对适应性免疫及固有免疫细胞稳态调节及其可能致病机制提供了实验基础。
第二部分1例IFIH1基因突变患儿临床表现及免疫学表型研究
目的：我院于2019年4月收治1例经高通量测序报告发现IFIH1基因新发位点突变患儿，该患儿临床表现为发热、咳嗽、多重呼吸道病毒反复感染，生长发育落后以及炎症性肠病，与文献报道该基因减功能所致原发性免疫缺陷病(PID)或增功能以致Aicardi–Goutières综合征(AGS)不完全相符，我们通过对该突变进行致病性预测及序列保守性分析，结合临床症状以及免疫学表型，探讨如何对IFIH1基因不同突变进行免疫学功能验证，避免PID患者漏诊、误诊。
方法：以1例IFIH1基因突变患儿为研究对象，收集并分析该患儿病史、免疫相关高通量测序结果并随访病情变化，采集患儿外周血并提取外周血单核细胞(PBMCs)，使用流式细胞术检测淋巴细胞亚群、Treg细胞亚群、低密度中性粒细胞(low density neutrophil, LDN)及经离子霉素刺激T细胞分泌Ⅲ型干扰素(IFN-γ)水平，同时利用ELISA检测Ⅰ型干扰素(IFN-α及IFN-β)干扰素水平。
结果：免疫相关高通量测序及cDNA一代测序证实IFIH1基因第15号外显子存在复合杂合突变(c.2808-2A>G来自母亲，c.2836G>A来自父亲)，流式细胞术检测经离子霉素刺激T细胞分泌Ⅲ型干扰素产生明显减少，经ELISA检测血浆IFN-α处于正常低限，IFN-β则低于正常，Treg细胞比例处于正常范围内，LDN细胞比例显著增高。
结论：本研究报道1例IFIH1基因新发突变、临床表型不典型的原发性免疫缺陷病患儿。对于临床症状表现为互相矛盾的IFIH1基因增功能疾病——Aicardi–Goutières综合征(AGS)和IFIH1基因减功能所致严重呼吸道感染，应进行深入免疫功能评估，挖掘病因，对于Ⅰ型干扰素分泌途径关键因子进行检测，鉴别突变所致为增功能或减功能，以及时、准确诊断相关病例并尽早治疗。
目的：课题组前期收治一例来自近亲婚配家庭的IKBKBc.1183T>C,p.Y395H基因突变患儿，临床表现为自幼反复感染、慢性腹泻、生长发育落后的联合免疫缺陷病(CID)；其外周血T、B细胞数量正常但功能受损。与以往确诊的IKBKB缺陷病例不同的是，该患儿病情较轻，生存期(造血干细胞移植前已经18岁)明显长于全球确诊的其他患儿，因而我们确认其为病情较轻的CID，其原因可能主要是具有不同性质的基因突变。NF-кB通路广泛参与多种免疫细胞功能发挥，其活化通路中的重要分子——IKBKB发挥着不可替代的作用。遗憾的是，IKBKB基因全敲小鼠胚胎致死，无法用于研究其变异对通路和各种免疫细胞功能研究，而Y395H定点纯合突变小鼠也许可以提供一个IKBKB敲低的可靠模型。因此，本研究拟通过CRISPR/Cas9技术构建同源位点突变小鼠，采用基因测序、Real-timePCR及Westernblot验证模型，对突变蛋白进行建模，并对其免疫学表型及中性粒细胞功能进行初步探讨，期望为深入研究该位点突变对免疫学功能的影响奠定基础，并为疾病的发病机制提供固有免疫证据。
方法：采用CRISPR/Cas9技术构建相应点突变模式小鼠，并提取小鼠基因组DNA进行PCR及一代测序、鉴定及扩繁，提取小鼠脾脏及胸腺淋巴细胞,采用Real-timePCR及Westernblot检测淋巴细胞中IKKs家族各亚基(IKKα、IKKβ和IKKγ)mRNA及蛋白的表达，并使用分子运行模式(MOE，Molecular Operating Environment)软件分析IKKβ蛋白PDB结构并建立3D模型。使用流式细胞术检验小鼠脾脏中Treg细胞比例；同时提取小鼠骨髓中性粒细胞，采用鲁米诺化学发光发检测中性粒细胞NADPH途径活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)及中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophils Extracellular Traps, NETs)水平变化。
结果：小鼠基因测序及Westernblot结果表明成功构建点突变稳定基因型小鼠，在脾脏和胸腺淋巴细胞中，与野生型小鼠相比,纯合突变小鼠IKBKBmRNA表达无明显变化,而IKKβ蛋白表达明显降低，用分子运行模式(molecular operating environment, MOE)软件分析蛋白PDB结构提示突变后的IKKβ蛋白其空间构型明显改变。分析表型发现脾脏Treg细胞比例也降低。对于小鼠骨髓成熟粒细胞，与野生型小鼠相比，突变型小鼠中性粒细胞胞外ROS没有统计学差异，但对于胞内ROS，突变型小鼠的呼吸爆发峰值降低。且突变型小鼠NETs基础值较野生型明显偏低，经PMA刺激后NETs变化趋势与野生型小鼠相比也较低。
结论：该研究初步表明IKBKBY397H突变导致小鼠脾脏及胸腺的淋巴细胞中IKKβ蛋白明显降低，Treg细胞比例下降以及骨髓中性粒细胞胞内途径呼吸爆发水平减少，且其释放NETs初始杀菌功能较正常对照降低，可能与突变导致蛋白结构发生改变而使其稳定性减低，影响免疫细胞的分化、发育和功能行使有关，但具体机制目前尚不清楚。本研究为进一步探究该位点突变对适应性免疫及固有免疫细胞稳态调节及其可能致病机制提供了实验基础。
第二部分1例IFIH1基因突变患儿临床表现及免疫学表型研究
目的：我院于2019年4月收治1例经高通量测序报告发现IFIH1基因新发位点突变患儿，该患儿临床表现为发热、咳嗽、多重呼吸道病毒反复感染，生长发育落后以及炎症性肠病，与文献报道该基因减功能所致原发性免疫缺陷病(PID)或增功能以致Aicardi–Goutières综合征(AGS)不完全相符，我们通过对该突变进行致病性预测及序列保守性分析，结合临床症状以及免疫学表型，探讨如何对IFIH1基因不同突变进行免疫学功能验证，避免PID患者漏诊、误诊。
方法：以1例IFIH1基因突变患儿为研究对象，收集并分析该患儿病史、免疫相关高通量测序结果并随访病情变化，采集患儿外周血并提取外周血单核细胞(PBMCs)，使用流式细胞术检测淋巴细胞亚群、Treg细胞亚群、低密度中性粒细胞(low density neutrophil, LDN)及经离子霉素刺激T细胞分泌Ⅲ型干扰素(IFN-γ)水平，同时利用ELISA检测Ⅰ型干扰素(IFN-α及IFN-β)干扰素水平。
结果：免疫相关高通量测序及cDNA一代测序证实IFIH1基因第15号外显子存在复合杂合突变(c.2808-2A>G来自母亲，c.2836G>A来自父亲)，流式细胞术检测经离子霉素刺激T细胞分泌Ⅲ型干扰素产生明显减少，经ELISA检测血浆IFN-α处于正常低限，IFN-β则低于正常，Treg细胞比例处于正常范围内，LDN细胞比例显著增高。
结论：本研究报道1例IFIH1基因新发突变、临床表型不典型的原发性免疫缺陷病患儿。对于临床症状表现为互相矛盾的IFIH1基因增功能疾病——Aicardi–Goutières综合征(AGS)和IFIH1基因减功能所致严重呼吸道感染，应进行深入免疫功能评估，挖掘病因，对于Ⅰ型干扰素分泌途径关键因子进行检测，鉴别突变所致为增功能或减功能，以及时、准确诊断相关病例并尽早治疗。