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异种间体细胞核移植技术可利用家畜的卵母细胞为核受体、以珍惜濒危动物或人类的体细胞为核供体构建异种间体细胞克隆胚,通过体内或体外培养获取胚胎干细胞或异种间克隆动物。这项技术为保护和拯救珍稀濒危动物、人类器官移植开辟了一条崭新的途径。但极低的成功率限制了这项技术在实践中的应用,这可能归因于体细胞核在异种卵母细胞中未能完全再程序化。此外,异种间克隆胚及克隆后代中存在广泛的线粒体杂合现象,即来源于供受体细胞的两套线粒体共存。影响异种间克隆胚及克隆后代中线粒体杂合性的因素还不清楚。合子型基因激活(ZGA)是胚胎早期发育过程中的关键性事件。ZGA发生后,合子型基因编码的大量糖蛋白抗原可能分泌于胚胎细胞表面。因此,胚胎细胞表面抗原的检测可用于研究克隆胚中ZGA发生的时间及供核的再程序化状况。本实验以体外培养成熟的绵羊卵母细胞为核受体,分别以绵羊胎儿成纤维细胞(SFFs)、山羊胎儿成纤维细胞(GFFs)为核供体构建同异种间体细胞克隆胚,通过体外培养观察两者在发育能力及发育速度方面的差异。此外,在早期发育的不同阶段(1-、2-、4-、8-、16-细胞、桑椹胚、囊胚),分别采用real-time PCR及real-time反转录-PCR(real-time RT-PCR)的方法检测了异种间克隆胚中供受体来源的线粒体DNA(mtDNA)及线粒体RNA(mtRNA)的含量和比例。最后,采用免疫细胞化学法分别检测了同异种间克隆胚在不同发育阶段(2-、4-、8-细胞、桑椹胚)细胞表面山羊、绵羊种属特异性抗原的分布。采用OM液体外培养屠宰场卵巢来源的绵羊卵母细胞,22～24 h后的成熟结果表明, 72.8%的卵母细胞可获得成熟(可见明显第一极体),70.3%的卵母细胞胞质形态较好,可用于核移植。同异种间克隆胚的体外发育结果表明,同种间克隆胚的体外囊胚发育率(16.0%)高于异种间克隆胚的体外囊胚发育率(7.4%),且这种差异主要是由异种间克隆胚在8-细胞到16-细胞及16-细胞到桑椹胚期间的发育能力显著低于同种间克隆胚(p<0.05)造成的。同异种间克隆胚的体外发育速度表明,两者在从2-细胞到8-细胞发育期间的发育速度基本相同,但异种克隆胚在从8-细胞到囊胚发育期间的发育速度明显低于同种克隆胚12～24 h。对不同发育阶段异种间克隆胚中供受体来源的mtDNA检测结果表明,供受体来源的mtDNA可共存于异种间克隆胚体外发育的所有阶段中;在异种间克隆胚从1-细胞到桑椹胚的发育期间,供受体来源的mtDNA拷贝数是相对稳定的;在从桑椹胚到囊胚的发育期间,核供体来源的mtDNA拷贝数明显的由5.6×103±0.8×103下降到6.1×102±1.5×102 ( p<0.01 ),然而,核受体来源的mtDNA拷贝数却明显的由3.2×105±1.3×105增加到5.4×106±0.4×106(p<0.01),这种供受体来源的mtDNA拷贝数相反方向的变化导致两者的比例由2.0%±1.0%下降到0.012%±0.004%,且彼此之间差异极显著(p<0.01)。对不同发育阶段异种间克隆胚中供受体来源的ND-1 mRNA检测结果表明,在异种间克隆胚由1-细胞到2-细胞的发育过程中,山羊特异性ND-1 mRNA的拷贝数由2.0×103±0.4×103下降到4.8×102±1.2×102,在由4-细胞到囊胚的发育过程中已检测不到山羊特异性ND-1 mRNA的存在;然而,在异种间克隆胚由1-细胞到8-细胞的发育过程中,绵羊特异性ND-1 mRNA的拷贝数是相对稳定的(1-细胞阶段为6.9×103±0.6×103,8-细胞阶段为7.6×103±0.9×103),在16-细胞阶段有所增加(2.8×104±0.7×104),在桑椹胚及囊胚阶段得到了迅速的增加(桑椹胚阶段为2.4×105±0.4×105,囊胚阶段为8.5×106±1.4×106);这种动态的变化导致了异种间克隆胚在发育过程中山羊特异性ND-1 mRNA拷贝数相对于绵羊特异性ND-1 mRNA拷贝数比例的下降。据此,我们提出了一种核供体来源的线粒体选择性降解的机制,即由于核供体来源的线粒体生物学功能受到抑制,从而导致其退化并被选择性地降解。对处于不同发育阶段同异种间克隆胚细胞表面抗原的检测结果表明,同种间克隆胚在2-、4-、8-细胞阶段只有微量的绵羊特异性抗原分布于细胞表面,到桑椹胚阶段绵羊特异性抗原的数量明显增加,从而表明了绵羊-绵羊同种间克隆胚ZGA发生的时间为8-细胞到桑椹胚期间;异种间克隆胚在2-、4-细胞阶段有微量的绵羊特异性抗原分布于细胞表面,但几乎检测不到山羊特异性抗原的存在,在异种间克隆胚的8-细胞及桑椹胚阶段,几乎已检测不到绵羊特异性抗原的存在,然而,山羊特异性抗原的数量却明显增加,从而表明了山羊-绵羊异种间克隆胚ZGA发生的时间同样为8-细胞到桑椹胚期间,同时说明了绵羊卵母细胞具有再程序化GFFs的能力。