现阶段,肿瘤是危害公众健康的一大难题,虽然总体死亡率呈下降趋势,但仍旧是人类死亡的头号杀手。放射治疗是肿瘤的重要治疗手段,可通过破坏细胞周期进程进而造成细胞死亡,来达到治疗肿瘤的目的。其直接靶点是DNA,DNA损伤修复机制被认为是肿瘤细胞的阿喀琉斯之踵,辐射造成细胞周期阻滞主要是为DNA损伤修复赢得时间,辐射通过造成严重的DNA损伤而无法修复进而促使肿瘤细胞发生凋亡或者衰老。α-地中海贫血/精神发育迟滞综合征X染色体相关基因(α-thalassemia/mental retardation syndrome X-linked,ATRX)可以参与DNA甲基化、DNA修复、端粒稳定和募集组蛋白变体H3.3等。本研究建立了靶向沉默ATRX的肿瘤细胞稳转模型,探讨电离辐射对细胞周期阻滞、DNA损伤修复、细胞凋亡和衰老、以及辐射增敏作用的影响及其分子机制,为探寻肿瘤辐射增敏新的分子靶点提供理论和实验数据。目的:研究靶向沉默ATRX对电离辐射诱导的肿瘤细胞周期阻滞的影响及分子机制,并进一步探讨对DNA损伤修复、细胞衰老和凋亡、放射敏感性的作用及相关分子机制,为探寻增敏肿瘤辐射新的分子靶点提供理论及实验数据。方法:1.设计3条靶向ATRX的shRNA序列克隆到慢病毒载体pGIZ上,利用293T细胞包装慢病毒后感染宫颈癌HeLa细胞,利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)和免疫印迹(Western blotting,WB)检测沉默效率,设立非靶序列为对照;在此基础上,利用shATRX的慢病毒继续感染结肠癌HCT116p53野生型和敲除型细胞,命名为shCon-p53+/+、shATRX-p53+/+、shCon-p53-/-和shATRX-p53-/-,并利用WB验证细胞模型沉默效率。2.使用X-RAD 320i X深部辐照仪进行照射,照射条件为:电压180 kV,电流20mA,靶距70 cm,剂量率1.0 Gy/min。3.shCon-p53+/+、shATRX-p53+/+、shCon-p53-/-和shATRX-p53-/-细胞经2和8 Gy照射后24和48 h,流式细胞术检测细胞周期变化;利用WB检测相关细胞周期蛋白的表达变化。4.shCon-p53+/+,shATRX-p53+/+,shCon-p53-/-和shATRX-p53-/-细胞经2和8 Gy照射后,利用CCK8试剂检测细胞增殖的变化。5.shCon-p53+/+,shATRX-p53+/+,shCon-p53-/-和shATRX-p53-/-细胞经0、2、4、6和8 Gy照射后,利用克隆形成计算细胞存活分数,绘制剂量存活曲线判断细胞敏感性的变化。6.shCon-p53+/+、shATRX-p53+/+、shCon-p53-/-和shATRX-p53-/-细胞经8 Gy照射后0、3、6和24 h收集细胞,利用免疫荧光技术检测γH2AX和Rad51荧光强度形成,并利用WB检测DNA损伤修复蛋白的表达。7.shCon-p53+/+、shATRX-p53+/+、shCon-p53-/-和shATRX-p53-/-细胞经4 Gy照射后0.5、1、2和4 d收集细胞,SA-β-gal试剂盒检测细胞衰老变化。8.shCon-p53+/+,shATRX-p53+/+,shCon-p53-/-和shATRX-p53-/-细胞经2和8 Gy照射后24和48 h,Annexin V和7-AAD凋亡试剂染色后,流式细胞术检测细胞凋亡的变化。9.shCon-p53+/+和shATRX-p53+/+细胞经过8 Gy招收后24 h,采取免疫沉淀技术(immunoprecipitation,IP)来探索检测ATRX、Daxx及p53之间的互作关系。10.统计学处理:采用SPSS24.0软件进行统计学分析,所得数据采用均数±标准差(x±s)的方式表示,多组间样本均数比较采用单因素方差分析,当P值小于0.05或0.01时则认为差异具有统计学意义。结果:1.成功地构建靶向沉默ATRX的HCT116(p53+/+和p53-/-)模型免疫荧光(IF)结果显示:shCon、shATRX1~#、shATRX2~#和shATRX3~#的HeLa细胞中均表达GFP,提示慢病毒感染成功,且ATRX蛋白在HeLa和shCon细胞中均表达,而在shATRX1~#、shATRX2~#和shATRX3~#中无表达,提示3条靶向序列沉默效率较好;同时,WB结果也证实了这个结果。基于此,利用shATRX和shCon慢病毒感染HCT116细胞,WB结果显示,ATRX蛋白在shCon-HCT116细胞中表达,而在shATRX-HCT116细胞中无或低表达,这些结果证明成功获得了沉默ATRX的HCT116(p53+/+和p53-/-)细胞模型,可用于后续实验。2.沉默ATRX对辐射诱导HCT116细胞周期阻滞的影响及分子机制0、2和8 Gy照射后24和48 h,随着照射剂量的加大和时间的延长,两种细胞均发生了G2/M期阻滞。当ATRX被沉默后,两种细胞均发生了S期延迟、而G2/M阻滞降低,甚至HCT116(p53+/+)细胞进入G0/G1期。WB结果显示:2和8 Gy照射后,两种细胞中p-ATM和p-Chk2表达增加,而ATRX沉默后,HCT116 p53野生型细胞经2 Gy照射后24 h时变化不明显,而48 h时则抑制,8Gy照射后,24 h时升高,直到48 h再降低;而HCT116 p53敲除型细胞经2和8 Gy照射后则24和48 h时二者表达则较对照组降低。另外,ATRX沉默后,辐射诱导S相延迟相关的Cyclin A表达降低,而G2/M期相关蛋白Cyclin B1和CDK1在p53敲除HCT116细胞中降低,而在p53野生型HCT116中则升高;且在HCT116细胞中,p-p53、p21和Gadd45α表达增加;提示ATRX沉默后细胞发生S相延迟,而辐射诱导G2/M期阻滞降低,但存在p53细胞则更多进入G0/G1期;ATRX可能通过调控p53发挥相应的周期进程调控。3.沉默ATRX增强辐射诱导细胞增殖抑制CCK8结果显示,经过辐射后,HCT116(p53+/+和p53-/-)细胞增殖变慢,而ATRX沉默细胞增殖能力降低更显著,且以p53野生型的HCT116细胞增殖能力下降的更为显著(P<0.05)。4.沉默ATRX对HCT16细胞放射敏感性的影响利用克隆形成检测细胞的存活分数变化,结果可见沉默ATRX后细胞经0、2、4、6和8 Gy照射,细胞的克隆数均降低,经过计算SF并进行拟合,绘制剂量-存活曲线,p53野生型和敲除型HCT116细胞曲线坡度均降低,提示放射敏感性增加。5.沉默ATRX增强辐射对DNA的损伤作用经8 Gy照射后3 h,HCT116细胞中γH2AX和Rad51荧光强度明显增加,一直持续到6 h,然后开始减少,而shATRX-p53-/-细胞中γH2AX焦点始终处于较高水平,而Rad51荧光强度水平较低。WB结果显示:辐射后γH2AX和XRCC1蛋白表达增加,Rad51蛋白表达则降低,且以shATRX-p53-/-中γH2AX蛋白表达增加更多,提示沉默ATRX的HCT116细胞DNA损伤的更严重。6.沉默ATRX对辐射诱导细胞衰老的影响0.5、1、2和4 d,p53敲除的HCT116细胞β-gal阳性细胞百分比在shCon和shATRX组间无明显差异,但是p53野生型HCT116细胞β-gal阳性细胞百分比在shCon组显著增加(P<0.05);而8 Gy辐射后,HCT116细胞β-gal阳性细胞百分比均增加,但shATRX-p53+/+细胞β-gal阳性细胞百分比增加较少,而shATRX-p53-/-细胞β-gal阳性细胞百分比增加较多。用源于2和8 Gy照射细胞的上清液刺激HCT116细胞,ATRX沉默的细胞上清液均有增殖抑制的作用。7.ATRX缺失增强辐射诱导细胞凋亡2和8 Gy照射后,辐射诱导ATRX沉默的HCT116细胞凋亡率均增加,但p53野生型HCT116细胞凋亡率凋亡率更高。同时,沉默ATRX的HCT116细胞中凋亡相关蛋白PARP-1,cleaved caspase-9和-3表达水平较高。8.ATRX、Daxx与p53之间的关系STRING蛋白互作预测发现,MDM2、p53和Daxx之间,Daxx和ATRX之间存在互作关系,推测ATRX可能调控p53。WB结果显示:ATRX沉默后,辐射诱导MDM2和Daxx降低,且p-p53表达增加,提示ATRX负调控p53。采用HCT116(p53+/+)细胞,在8 Gy照射24 h,提取蛋白,IP实验证实,ATRX与Daxx可以互作,而与MDM2和p53无互作;但是Daxx可以与ATRX,MDM2和p53相互作用。上述结果提示,ATRX通过Daxx负调控p53。结论:1.靶向沉默ATRX的3条序列均具有抑制ATRX表达作用,本研究成功地构建了稳定沉默ATRX的HeLa细胞和HCT116细胞模型。2.沉默ATRX后,HCT116细胞主要发生S相延迟,而电离辐射诱导G2/M期阻滞,并增强S相延迟;在有p53时,辐射诱导HCT116细胞更多进入G0/G1期。3.辐射诱导沉默ATRX的HCT116细胞增殖抑制更明显,对p53野生型和敲除细胞具有辐射增敏作用。4.ATRX沉默后,辐射诱导HCT116细胞的DNA损伤修复能力降低。5.辐射诱导HCT116细胞衰老,ATRX沉默后则衰老降低,p53敲除后,则辐射诱导衰老增加更明显,可能ATRX与p53协同抑制辐射诱导的细胞衰老,但对于辐射抑制细胞增殖具有正向作用。6.辐射可诱导HCT116细胞凋亡,ATRX可与p53协同增强这种辐射促凋亡作用。7.WB和IP实验证实,ATRX可以通过Daxx参与MDM2/p53的负反馈调控。