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转基因的表达调控,在基因治疗中起着举足轻重的作用。随着对RNA功能研究的日益深入,越来越多的研究者在选择调控工具时,将目光转向非编码RNA(noncoding RNA,nc RNA)。尤其是小的人工合成的nc RNA,工作效率高、免疫原性低,可以作为理想的基因治疗调控工具。而核糖开关(riboswitch)的发现,又为nc RNA在基因表达调控中的研究和应用翻开了新篇章。核糖开关由适体和表达平台两部分序列构成。适体域与其相应配体的结合可引起整个核糖开关二级结构的变化,从而控制转基因的表达。配体的结合可引起转基因表达量上升的核糖开关为ON型开关,反之为OFF型开关。人工构建的核糖开关,即根据其自然构成方式进行设计。核酶型核糖开关(或核酶核糖开关,简称核酶开关),使用核酶作为表达平台,通过调控核酶自身剪切的能力来控制转基因的表达。因其结构和作用机制都较为简单,成为目前研究的热点。本文介绍的HTRS-1(Hammerhead Theophylline Riboswitch 1)型核酶开关,通过人工合理设计,由茶碱适体和烟草环斑病毒锤头状核酶构成,属于ON型核糖开关。可使用重组质粒载体或重组腺相关病毒(recombinant adeno-associ-ated virus,r AAV)进行,在哺乳动物细胞中发挥作用。实验证明:HTRS-1核酶开关能够针对多种转基因、在多种哺乳动物细胞中发挥调控转基因表达的作用,但调控能力会因转基因或宿主细胞种类的不同而有所改变,单个HTRS-1核酶开关对转基因表达的调控倍数约在1.7~3.7倍不等。针对核酶开关调控转基因表达时存在的不足(如基础表达量低,调控范围(调控倍数)窄等),本文对HTRS-1核酶开关的结构进行了改造,包括:其催化核心环上的选择性起始密码子的突变消除;HTRS-1核酶开关在转基因UTR插入位置的筛选;多个HTRS-1核酶开关的串联等。结果显示:采用不同方式改造的核酶开关,调控转基因表达的效果不同。最终得到动力学性能最好的核酶开关,是同时在转基因序列两端UTR中插入核酶开关的复合型核酶开关,其调控倍数可达5倍。本文的研究结果,为人工核酶核糖开关的设计和优化改造提供了依据;为核糖开关日后在临床中的应用,提供了依据。