胃癌(gastric cancer,GC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着人民的健康和生活质量。尽管现在我国对胃癌的诊断及治疗水平有很大提高,但大多数胃癌患者就诊时已属中晚期,不能手术根治,且放化疗并未能明显延长患者的生存期。目前针对胃癌机制的研究主要集中在增殖、侵袭方面。凋亡是哺乳动物细胞程序性死亡的主要机制,大量研究认为,凋亡减少是引起肿瘤发生的重要原因之一。膜联蛋白A家族是一类钙离子依赖的磷脂结合蛋白超家族,它们都参与了细胞许多重要功能的调节,如胞饮、胞吐、细胞骨架、离子通道、细胞增殖、细胞凋亡等。膜联蛋白A7(annexin A7,ANXA7)也称为会联蛋白(synexin),属于膜联蛋白A家族,在多种肿瘤中表达异常。目前关于ANXA7在胃癌凋亡中的作用及其分子机制仍不明确。本研究应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)及蛋白印迹法(western blot)检测胃癌组织和癌旁组织中ANXA7 m RNA和蛋白的表达;应用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测胃癌患者及正常人血清中ANXA7,探讨ANXA7在胃癌血清及组织中表达的意义;进一步分析胃癌组织中ANXA7表达与胃癌临床病理因素的关系。再分别以人不同分化程度胃癌组织、胃癌细胞株为研究对象,应用q RT-PCR、western blot、原位末端转移酶标记法(TUNEL)、流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)等方法分析胃癌中ANXA7的表达与分化、凋亡的关系;应用体外细胞培养技术和RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,观察抑制ANXA7表达对人低分化胃腺癌细胞株BGC-823和人胃癌BGC-823细胞裸鼠皮下移植瘤凋亡的影响,及对凋亡相关基因(Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9)表达、caspase-3及caspase-9活性、MAPK信号传导通路ERK1/2、JNK1/2/3、p38蛋白表达的影响,为研究ANXA7在胃癌凋亡中的作用以及以ANXA7为新靶点的胃癌分子靶向性治疗提供初步的实验依据和理论基础。本研究共分为五个部分:第一部分膜联蛋白A7在胃癌中的表达及其与胃癌临床病理因素的关系目的:检测ANXA7在胃癌组织及配对癌旁组织、胃癌患者及正常人血清中的表达情况,分析ANXA7在胃癌中的意义。方法:选取2013年1月~2015年12月间河北医科大学第四医院外三科因胃癌入院行根治术并术后病理证实为胃癌的患者105例,收集其晨起空腹血、新鲜胃癌组织及其癌旁组织手术标本。取同期体检的正常人50例作为对照组。应用q RT-PCR及western blot检测胃癌组织和癌旁组织中ANXA7 m RNA和蛋白的表达情况;应用ELISA法检测胃癌组及对照组血清中ANXA7,分析ANXA7在胃癌中的意义,并进一步分析胃癌组织中ANXA7与临床病理因素的关系。结果:1 q RT-PCR和western blot技术检测105对胃癌组织和配对癌旁组织中ANXA7 m RNA和蛋白的表达,结果显示ANXA7 m RNA和蛋白在胃癌组织中的表达均高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。2 ELISA法检测胃癌组与正常对照组血清中ANXA7蛋白浓度分别为(78.620±11.249)ng/L、(54.971±9.548)ng/L,胃癌组血清ANXA7蛋白浓度明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。胃癌组与对照组ROC曲线的曲线下面积AUC为0.941,以67.21ng/L为胃癌患者与正常人的临界值,对胃癌诊断的敏感性为81.90%,特异性为94.0%。3 Spearman相关分析显示胃癌组织与外周血中ANXA7蛋白表达呈正相关(r=0.607,P<0.05)。4分析胃癌组织中ANXA7 m RNA和蛋白水平与胃癌患者临床病理因素的关系,结果显示ANXA7的m RNA和蛋白表达在不同分化程度的胃癌组织中差异有统计学意义(P<0.05),且随着分化程度越低,表达水平越高;在不同肿瘤浸润深度的组织中,只有T1和T4期组织中ANXA7的m RNA和蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05),且T4期明显高于T1期;在有淋巴结转移的胃癌组织中ANXA7的m RNA表达比无淋巴结转移的胃癌组织中的高,二者差异有统计学意义(P<0.05),但ANXA7的蛋白表达在二者中差异无统计学意义(P>0.05);胃癌组织中ANXA7的m RNA和蛋白表达在性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型方面差异均无统计学意义(P>0.05)。小结:1胃癌组织中ANXA7 m RNA和蛋白表达高于癌旁组织。2 ANXA7在胃癌患者血清中明显高于正常对照组,以67.21ng/L为胃癌患者与正常人的临界值,对胃癌诊断的敏感性为81.90%,特异性为94.0%,ANXA7可能作为新的胃癌血清标志物。3胃癌组织与外周血中ANXA7蛋白表达呈正相关。4胃癌组织中ANXA7的表达与肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度和淋巴结转移有关;与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型无关。第二部分膜联蛋白A7表达与胃癌分化、凋亡相关性研究目的:检测高、中、低分化胃癌组织及胃癌细胞株中ANXA7的表达情况及凋亡情况,分析ANXA7表达与肿瘤分化、凋亡的关系。方法:收集高、中、低分化胃腺癌组织标本105例及人高、中、低分化胃腺癌细胞株MKN74、SGC7901、BGC823,采用q RT-PCR、western blot检测ANXA7 m RNA和蛋白的表达情况;TUNEL法检测不同分化程度胃癌组织的凋亡情况;FCM检测不同分化程度胃癌细胞株的凋亡情况;分析ANXA7的表达与胃癌分化程度、凋亡的关系。结果:1 q RT-PCR和western blot检测高、中、低分化胃癌组织中ANXA7的表达,结果显示ANXA7在不同分化程度胃癌组织中均表达,且分化程度越低,表达越高,差异均有统计学意义(P<0.05);q RT-PCR和western blot检测高、中、低分化胃癌细胞株中ANXA7的表达,结果显示ANXA7在不同分化程度胃癌细胞株中均表达,且分化程度越低,表达越高,差异均有统计学意义(P<0.05)。2 TUNEL检测高、中、低分化胃癌组织的凋亡指数分别为(18.12±2.40)%、(9.73±1.73)%、(4.13±0.83)%,差异均有统计学意义(P<0.05)3 FCM检测MKN74、SGC7901和BGC823组细胞凋亡率分别为(10.07±1.21)%、(7.11±1.04)%、(4.25±1.02)%,差异均有统计学意义(P<0.05)。4 Spearman等级相关分析结果显示,人胃癌组织ANXA7 m RNA和蛋白表达与胃癌分化程度呈负相关(r=-0.926,P<0.05;r=-0.950,P<0.05),胃癌组织凋亡指数与分化程度呈正相关(r=0.949,P<0.05),胃癌组织凋亡指数与ANXA7 m RNA和蛋白的表达呈负相关(r=-0.978,P<0.05;r=-0.973,P<0.05);胃癌细胞株ANXA7 m RNA和蛋白表达与胃癌分化程度呈负相关(r=-0.934,P<0.05;r=-0.938,P<0.05),胃癌细胞株凋亡率与分化程度呈正相关(r=0.936,P<0.05),胃癌细胞株凋亡率与ANXA7m RNA和蛋白的表达呈负相关(r=-0.917,P<0.05;r=-0.933,P<0.05)。小结:1胃癌组织和细胞株中ANXA7在m RNA和蛋白的表达与分化程度均呈负相关,即随着胃癌分化程度的下降,ANXA7的表达逐渐增加。2胃癌组织和细胞株中凋亡与分化程度均呈正相关,即随着胃癌分化程度的下降,凋亡细胞随之减少。3胃癌组织和细胞株中ANXA7的表达水平与凋亡呈负相关,即随着ANXA7表达增高,凋亡指数/凋亡率呈下降趋势。ANXA7对凋亡有抑制作用,在胃癌的发生发展过程中可能起到癌基因的作用。第三部分抑制膜联蛋白A7表达对胃癌BGC823细胞凋亡的影响目的:探讨抑制ANXA7表达对人胃癌BGC823细胞凋亡及凋亡相关基因(Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9)的影响。方法:构建沉默ANXA7的特异si RNA序列转染人低分化胃腺癌细胞株BGC823,转染靶向ANXA7-si RNA-3的细胞为实验组(si ANXA7组)、转染NS-si RNA的细胞为阴性对照组(si NS组),空白对照组(Ctrl组)BGC823细胞不做任何处理。FCM检测转染前后BGC823细胞的凋亡率的变化;应用q RT-PCR和western blot检测转染前后凋亡相关基因Bcl-2、Bax、caspases-3、capase-9 m RNA及蛋白表达的改变;检测转染前后caspase-3和caspase-9活性的变化。结果:1 ANXA7-si RNA转染BGC823细胞后,q RT-PCR、western blot检测发现si ANXA7组细胞ANXA7的m RNA和蛋白表达均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),si NS组与Ctrl组相比差异无统计学意义(P>0.05)。2 FCM检测si ANXA7组、si NS组、Ctrl组细胞凋亡率分别为(24.87±4.80)%、(4.57±0.31)%和(3.89±0.28)%,与Ctrl组及si NS组相比,si ANXA7组细胞凋亡率明显升高(P<0.05),si NS组与Ctrl组相比差异无统计学意义(P>0.05)。3 q RT-PCR、western blot技术检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9表达,结果发现与Ctrl组及si NS组相比,si ANXA7组细胞中Bcl-2的m RNA和蛋白表达明显减低,而Bax、caspase-3、caspase-9的m RNA和蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。si ANXA7组caspase-3、caspase-9的活性分别为Ctrl组的2.95倍、3.70倍,较转染前明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),上述指标si NS组与Ctrl组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。小结:1 ANXA7-si RNA能有效抑制BGC823细胞中ANXA7的m RNA和蛋白表达。2 ANXA7表达下调后BGC823细胞凋亡率增加,表明ANXA7在胃癌发生发展中具有重要的生物学作用,是胃癌细胞凋亡的一个重要调控蛋白,可抑制胃癌细胞的凋亡,起到癌基因的作用。3抑制ANXA7表达后可能是通过提高caspase-3、caspase-9活性,下调Bcl-2的表达,上调Bax、caspase-3、caspase-9的表达,在促进胃癌细胞凋亡中发挥重要作用。第四部分抑制膜联蛋白A7表达对胃癌BGC823细胞MAPK信号转导通路的影响目的:探讨抑制ANXA7表达对MAPK家族中ERK1/2、JNK1/2/3、p38蛋白表达的影响,分析MAPK信号转导通路对胃癌凋亡的影响。方法:应用RNA干扰技术转染人胃低分化腺癌细胞株BGC823,western blot技术检测转染前后MAPK家族中ERK1/2、JNK1/2/3、p38蛋白表达和磷酸化水平的变化。结果:1 western blot结果显示Ctrl组(空白对照组)、si NS组(阴性对照组)及si ANXA7组(实验组)细胞ERK1/2蛋白表达及其磷酸化水平差异均无统计学意义(P>0.05)。2 western blot结果显示Ctrl组、si NS组及si ANXA7组细胞JNK1/2/3蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),与Ctrl组及si NS组细胞相比,si ANXA7组JNK1/2/3的磷酸化水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。3 western blot结果显示Ctrl组、si NS组及si ANXA7组细胞p38蛋白表达及其磷酸化水平差异均无统计学意义(P>0.05)。小结:1抑制ANXA7在BGC823细胞中表达,ERK1/2、JNK1/2/3及p38蛋白表达及ERK1/2、p38磷酸化水平无明显变化,JNK1/2/3蛋白磷酸化水平明显下降。2 JNK信号通路可能参与了ANXA7低表达促进胃癌BGC823细胞凋亡的过程。第五部分抑制膜联蛋白A7表达对人胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤凋亡的影响目的:分析抑制ANXA7表达对人胃癌BGC823细胞裸鼠皮下移植瘤凋亡的影响及凋亡相关基因的改变,进一步探讨ANXA7在胃癌凋亡中的作用及分子机制。方法:将人胃低分化腺癌细胞株BGC823注入裸鼠右侧腋部皮下,建皮下移植瘤模型,成瘤后将重组质粒ANXA7-sh RNA(sh ANXA7组)、NS-sh RNA(sh NS组)及saline(Ctrl组)注入瘤内,观察裸鼠移植瘤的生长情况,测量肿瘤体积和重量;q RT-PCR和western blot检测ANXA7在各组移植瘤组织中的m RNA和蛋白的表达;FCM测量各组的凋亡率;q RT-PCR和western blot检测凋亡相关基因(Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9)表达;检测caspase-3、caspase-9活性。结果:1 15只实验裸鼠均见肿瘤生长,移植瘤成瘤率100%。2 q RT-PCR和western blot检测移植瘤ANXA7表达,结果显示与sh NS组、Ctrl组相比,sh ANXA7组ANXA7的m RNA和蛋白表达明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),sh NS组与Ctrl组相比差异无统计学意义(P>0.05)。3 sh ANXA7组、sh NS组、Ctrl组肿瘤体积分别为:(614.72±121.72)mm3、(955.82±152.29)mm3、(1072.65±238.47)mm3,与Ctrl组和sh NS组比较,sh ANXA7组裸鼠移植瘤体积明显减小,差异有统计学意义(P<0.05),sh NS组与Ctrl组相比差异无统计学意义(P>0.05)。sh ANXA7组、sh NS组、Ctrl组肿瘤重量分别为:(1.36±0.39)g、(2.13±0.32)g、(2.20±0.34)g,与Ctrl组和sh NS组比较,sh ANXA7组裸鼠移植瘤重量明显减轻,差异有统计学意义(P<0.05),sh NS组与Ctrl组相比差异无统计学意义(P>0.05);sh ANXA7组抑瘤率明显较高。4 FCM检测sh ANXA7组、sh NS组、Ctrl组移植瘤凋亡率分别为(20.20±0.83)%、(6.10±0.21)%和(6.03±0.12)%,与Ctrl组和sh NS组比较,sh ANXA7组凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),sh NS组与Ctrl组相比差异无统计学意义(P>0.05)。5 q RT-PCR和western blot检测各组凋亡相关基因Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9表达,结果显示与Ctrl组及sh NS组相比,sh ANXA7组中Bcl-2的m RNA和蛋白表达明显减低,而Bax、caspase-3、caspase-9的m RNA和蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),上述指标sh NS组与Ctrl组相比差异无统计学意义(P>0.05)。6 sh ANXA7组caspase-3、caspase-9的活性明显升高,分别为Ctrl组的1.78倍、2.71倍,差异有统计学意义(P<0.05),上述指标sh NS组与Ctrl组相比差异无统计学意义(P>0.05)。小结:1成功构建BGC823细胞裸鼠皮下移植瘤模型,成瘤率100%。2重组质粒ANXA7-sh RNA能明显抑制裸鼠移植瘤中ANXA7的表达,有效抑制人胃癌裸鼠皮下移植瘤的生长,使移植瘤体积减小、重量减轻。3抑制ANXA7表达能促进人胃癌裸鼠皮下移植瘤发生凋亡。4抑制ANXA7表达后促进人胃癌BGC823细胞裸鼠皮下移植瘤凋亡可能与提高caspase-3和caspase-9活性,下调Bcl-2的表达,上调Bax、caspase-3、caspase-9的表达有关。结论:1胃癌组织中ANXA7表达高于癌旁组织。2 ANXA7在胃癌患者血清中明显高于正常对照组,ANXA7可能作为新的胃癌血清标志物。3胃癌组织中ANXA7的达与肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度和淋巴结转移有关,与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型无关。4胃癌中ANXA7的表达与分化、凋亡呈负相关。5抑制ANXA7在BGC823细胞中表达,细胞凋亡率增加,可能与提高caspase-3、caspase-9活性,下调Bcl-2表达,上调Bax、caspase-3、caspase-9表达有关。6抑制ANXA7在BGC823细胞中表达JNK1/2/3蛋白的磷酸化水平下降,JNK信号通路可能参与了ANXA7低表达促进胃癌细胞凋亡的过程。7抑制裸鼠移植瘤中ANXA7表达能有效抑制人胃癌裸鼠皮下移植瘤的生长,增加裸鼠皮下移植瘤肿瘤细胞的凋亡率;可能与提高caspase-3和caspase-9活性,下调Bcl-2的表达,上调Bax、caspase-3、caspase-9的表达有关。8 ANXA7在胃癌中可能起到癌基因的作用,是一个重要的分子靶点,ANXA7有可能成为一个可用于胃癌诊断、治疗的潜在生物学标志物。