论文部分内容阅读
香蕉枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,简称FOC)是香蕉的毁灭性土传病害,尤其是香蕉枯萎病菌4号生理小种,几乎能感染所有的香蕉种类,具有极强的致病性,已在我国的广东、广西、海南、福建和云南等地均发生了严重的危害。迄今为止尚无有效的化学药剂防治香蕉枯萎病,因此,利用生防菌进行生物防治已是目前的一大热点。根际土壤放线菌是一类具有高度多样性的微生物,能够产生多种有益的代谢产物,在植物病害的生物防治中具有良好的开发及应用前景。本研究通过对木薯的根际土壤进行放线菌的分离及纯化,筛选得到2株对香蕉枯萎病菌具有高效抑菌活性的拮抗放线菌,同时对获得的拮抗放线菌进行分类鉴定和发酵条件的优化,以期能为根际土壤放线菌在防治香蕉枯萎病方面的开发应用奠定基础。主要研究结果如下:(1)从木薯的根际土壤中总共分离得到63株放线菌。通过与FOC4病菌的对峙培养实验,筛选得到2株具有较好拮抗活性的放线菌菌株,编号分别为MS13和1-14。对拮抗放线菌菌株进行抑菌谱的测定发现1-14菌株的抑菌谱较广,对7个属的11种靶标菌均表现出很好的拮抗作用,抑菌率均在77%以上,对辣椒炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)的抑菌活性最好,抑菌率达到97.59%,对FOC4病菌(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense)抑菌率也达到 87.65%。(2)通过形态学观察、生理生化测定以及分子生物学方法对MS13和1-14菌株进行分类地位的鉴定,初步将MS13菌株鉴定为细链孢菌属,将1-14菌株初步鉴定为链霉菌属。(3)根据1-14菌株的三种发酵培养基(MB发酵培养基、黄豆粉发酵培养基和基础发酵培养基)的粗提物对十种靶标病原菌的抑菌活性进行比较发现,基础发酵培养基的抑菌活性明显优于其它的两种培养基,其抑菌活性均大于36.15%,且对FOC4病菌的抑菌活性也达到了 43.80%。同时1-14菌株的基础发酵培养基滤液对FOC4病菌的孢子也具有较好的抑制作用。因此,确定基础发酵培养基为1-14菌株的优选发酵培养基。(4)采用响应面优化法对放线菌1-14菌株的发酵条件进行优化,主要包括以下试验:单因素实验、Plackett-Burman试验设计、最陡爬坡试验和BBD试验设计。优化后的发酵培养基组成为:葡萄糖38.877 g/L,黄豆粉20 g/L,CaCl2·2H2O 0.161 g/L,MgSO4 0.2 g/L,NaH2PO4 0.5 g/L,K2HPO4 0.5 g/L,pH 值为 8.0,温度为 29.97 ℃,接种量为8.93%。按最优后的发酵条件进行生物活性测定,链霉菌1-14菌株的抑菌率达到了 56.13%,比优化前(43.80%)提高了 12.33%。(5)放线菌1-14菌株发酵粗提物的稳定性测定结果表明,放线菌1-14菌株的发酵粗提物对热(50-100℃)相对稳定,而对酸碱和紫外线的稳定性较差,4 ℃储存比室温储存要更稳定。(6)通过采用室内模拟法,研究在灭菌土壤和自然土壤中1-14菌株单独接种和与FOC4病菌混合接种的数量变化。结果表明:第一,1-14菌株在土壤中的繁殖及其存活的能力受土著微生物的影响较大。因为土壤经过高温灭菌处理后,能显著性地提高1-14菌株在土壤中的存活能力。第二,在灭菌土壤中单独接种1-14菌株的数量变化呈先增加后降低的趋势,1-14菌株数量的下降可能与土壤的水分和养分等环境条件的变化有关。第三,1-14菌株对FOC4病菌具有极强的抑制作用。因为在自然土壤和灭菌土壤中FOC4病菌的数量皆很少甚至不生长。