子痫前期(pre-eclampsia,PE)是指妊娠20周以后出现新发的高血压,且伴有蛋白尿或其他系统损害的一种妊娠期并发症。现在的发病率已达到3-5%,严重的系统损害使其成为孕妇围产期发病率和死亡率升高的主要原因,而子痫前期的发病机制尚未明确。滋养细胞作为人类胎盘的主要组成部分,在维持正常妊娠的过程中发挥着不可替代的作用,其来源于囊胚表面的滋养层,在晚期囊胚黏附于子宫内膜时,滋养细胞开始分化,并侵袭入子宫内膜、内1/3肌层及血管,保证胎盘接受足够的血流供应,维持胚胎正常发育。已有研究证实,滋养细胞的侵袭不足会导致子痫前期的发生。线粒体偶联因子6(coupling factor 6,CF6)又称ATP5J,是ATP合酶的一部分,表达于多种细胞的线粒体及细胞膜上,参与ATP的合成和水解,以供给细胞能量,并能被分泌入血液,以循环肽的形式与相应配体结合,激活下游信号,引起血管稳态的改变。有研究发现,在某些缺血缺氧性心肌病中,出现了CF6的高表达,提示缺血缺氧可能促进了该因子的表达和释放,而相较于正常晚孕期产妇和正常育龄期未孕妇女,PE产妇的外周血中出现了明显的CF6的升高。因此我们猜想,胎盘可能表达并分泌了一部分CF6,参与了子痫前期患者外周血中CF6的升高。本研究期望通过检测子痫前期孕妇胎盘滋养细胞中CF6 mRNA和蛋白的表达,探讨CF6与PE发病的相关性。人绒毛膜癌滋养细胞系JAR与JEG-3细胞具有与滋养细胞相似的分子结构和生物学性状,常代替正常滋养细胞,用以研究其生物学行为。本文在研究CF6与PE发病相关性的基础上,探讨CF6对滋养细胞生物学行为的影响及其与PE发病的关系,为明确子痫前期发病机制提供新的研究方向。目的检测子痫前期患者胎盘组织中线粒体偶联因子6(coupling factor 6,CF6)的表达情况,探讨其与子痫前期发病的相关性。研究缺氧条件下,CF6在滋养细胞系JAR及JEG-3中的表达、分泌情况,及外源性CF6对滋养细胞生物学行为的影响,初步探索CF6在子痫前期发病中的作用。材料和方法1研究对象胎盘绒毛滋养细胞组织芯片(villous cytotrophoblast,VCT)和绒毛外滋养细胞组织芯片(extravillous cytotrophoblast,EVCT)用来检测CF6在胎盘组织中的表达定位。两种芯片的胎盘组织来源于2007年12月到2010年12月间在郑州大学第三附属医院住院的,临床诊断为子痫前期的患者胎盘80例,同期正常晚孕产妇胎盘58例。另收集60例新鲜胎盘组织用以检测CF6 mRNA和蛋白在胎盘组织中的表达水平,该胎盘组织来源于2015年1月至2016年1月在郑州大学第三附属医院分娩的重度子痫前期(severe preeclampsia,sPE)患者30例,同期分娩的正常对照孕妇30例。滋养细胞系JAR和JEG-3购自中国医学科学院,使用完全培养基(RPMI-1640基础培养基、10%FBS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素),置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中进行培养,待生长至对数期进行后续试验。2方法免疫组化SABC法检测CF6蛋白在胎盘VCT及EVCT组织芯片中的定位和表达情况。实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测CF6在新鲜胎盘组织中的表达情况。正常培养两株滋养细胞系JAR和JEG-3,采用氯化钴(cobalt chloride,CoCl2)培养细胞以构建缺氧细胞模型,免疫印迹法检测细胞中缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)蛋白的表达,评价细胞缺氧模型的构建成功与否。缺氧培养24h,酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测正常对照组及缺氧组细胞培养液中CF6的浓度,实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测CF6在两组滋养细胞中的表达。正常培养基中加入外源性人重组CF6蛋白进行干预,继续培养24h后,MTT法检测对照组和CF6实验组细胞增殖力的变化,Transwell法检测滋养细胞侵袭力的变化,实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测两组细胞MMP-2、MMP-9表达。3统计学处理本研究中所有数据均采用SPSS 22.0版本软件进行统计学分析处理,定量资料符合正态分布的数据以?x±s的方式表示,两独立样本t检验进行分析;非正态分布的数据采用M(P25~P75)的方式表示,非参数检验进行分析;重复测量资料采用重复测量资料的多因素方差分析;定性资料采用非参数检验,以α=0.05为检验水准。结果1 CF6蛋白在胎盘组织芯片中的定位和表达CF6蛋白在PE组与对照组的胎盘VCT及EVCT组织芯片中均有表达,主要表达于滋养细胞的细胞质及细胞膜。VCT组织芯片中,对照组CF6阳性表达率为71.4%,PE组CF6阳性表达率为83.9%,其中sPE组为87.5%;EVCT组织芯片中,对照组CF6阳性表达率为75.9%,PE组CF6阳性表达率为83%,其中sPE组为81.8%。无论VCT或EVCT组织芯片,CF6在sPE胎盘组织中的表达均明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)2胎盘组织中CF6 mRNA及蛋白的表达对照组与sPE组胎盘组织中均可检测到CF6 mRNA和蛋白的表达,sPE组CF6 mRNA的相对表达量为(1.522±0.727),对照组CF6 mRNA的相对表达量为(1.000±0.566);sPE组与正常对照组胎盘组织CF6蛋白的表达分别为0.282(0.111~0.341),(0.180±0.105)。与对照组比较,CF6 mRNA和蛋白在sPE胎盘组织中的表达均升高,且差异有统计学意义(P<0.05)。3缺氧细胞模型的构建免疫印迹法检测经CoCl2干预培养的JAR和JEG-3细胞中HIF-1α蛋白的表达,JAR细胞的对照组和CoCl2处理组HIF-1α蛋白表达分别为(0.311±0.193),(1.170±0.295);JEG-3细胞的对照组和CoCl2处理组HIF-1α蛋白表达分别为(0.210±0.101),(0.795±0.304)。经CoCl2处理后,细胞中HIF-1α蛋白表达明显增高,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),提示细胞缺氧,即缺氧细胞模型构建成功。4缺氧条件下细胞培养液中CF6的浓度ELISA法检测显示,对照组与缺氧组的JAR及JIG-3细胞均能分泌CF6,且缺氧组细胞培养液中的CF6浓度明显高于正常对照组。JAR细胞的对照组与缺氧组培养液中CF6浓度分别为(1.444±0.621)ng/ml,(2.223±0.662)ng/ml;JEG-3细胞的对照组与缺氧组培养液中CF6浓度分别为(1.691±0.392)ng/ml,(2.106±0.508)ng/ml,差异均有统计学意义(P<0.05)。5缺氧条件下细胞中CF6的表达Real-time PCR及免疫印迹法检测显示,缺氧组与正常对照组的JAR及JIG-3细胞均表达CF6 mRNA和蛋白,但CF6 mRNA在两株细胞的对照组和缺氧组中表达水平的差异均无统计学意义(P>0.05),其中,JAR两组细胞的表达为(1.000±0.466),(1.361±0.507);JEG-3两组细胞的表达为(1.000±0.357),(0.974±0.308)。而两株细胞缺氧组CF6蛋白的表达均明显高于对照组,对照组和缺氧组JAR细胞中的CF6蛋白表达量分别为(0.270±0.163),(0.464±0.205);对照组和缺氧组JEG-3细胞中的CF6蛋白表达量分别为(0.194±0.118),(0.385±0.205),差异具有统计学意义(P<0.05)。6 CF6刺激下滋养细胞的增殖情况MTT法检测显示,分别在细胞培养基中加入CF6后继续培养,并于0h、6h、12h、18h、24h这五个时间点检测细胞的吸光度OD值,并绘制细胞增殖曲线,CF6刺激组的细胞增殖较正常对照组略有降低,经重复测量资料的多因素方差分析,差异无统计学意义(P>0.05)。7 CF6刺激下滋养细胞的侵袭情况Transwell实验检测显示,两株细胞CF6刺激组的细胞侵袭数均明显少于正常对照组,对照组和CF6刺激组JAR细胞的侵袭细胞数分别为(86.17±20.56)个,(63.67±19.78)个;两组JEG-3细胞的侵袭细胞数分别为(87.06±12.03)个,(73.67±10.53)个,差异均有统计学意义(P<0.05);两株细胞CF6刺激组的MMP-2表达水平均明显低于正常对照组,对照组和CF6刺激组JAR细胞中MMP-2 mRNA的表达分别为(1.000±0.360),(0.346±0.221),MMP-2蛋白的表达分别为(0.410±0.192),(0.201±0.186);JEG-3细胞中MMP-2 mRNA的表达分别为(1.000±0.402),(0.671±0.229),MMP-2蛋白的表达分别为(0.528±0.236),(0.251±0.154)差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组和CF6刺激组JAR细胞中MMP-9 mRNA的表达分别为(1.000±0.384),(0.880±0.242),MMP-9蛋白的表达分别为(0.241±0.110),(0.240±0.184);JEG-3细胞中MMP-9 mRNA的表达分别为(1.000±0.336),(0.959±0.326),MMP-9蛋白的表达分别为(0.370±0.201),(0.349±0.219)差异均无统计学意义(P>0.05)结论缺氧可能促进了胎盘滋养细胞中CF6的表达和分泌,通过影响周围滋养细胞的侵袭力,干扰螺旋动脉重铸,损伤母体血管内皮细胞,参与子痫前期的发生。