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背景和目的:胃癌是我国最常见的消化系统恶性肿瘤之一,发病率和死亡率均高居恶性肿瘤第二位,约占全球胃癌发病和死亡的一半。目前胃癌的治疗是以手术为主。不能采用手术方式治疗的胃癌患者主要治疗措施包括放化疗、免疫、靶向治疗等,部分晚期患者不能耐受放化疗。针对这部分患者光动力治疗（Photodynamic therapy,PDT）是有效的治疗手段。PDT是一种物理治疗,它杀伤作用强,创伤小,可以单独使用也可与其他治疗联合使用,是延长晚期肿瘤患者存活期的有效手段,得到了越来越多的认识和推广。我们在前期研究中发现PDT后内镜观察和病理检查均见急性炎症改变,这与焦亡的特征一致。因此本研究目的是探索光动力诱导胃恶性肿瘤细胞发生焦亡的机制及对免疫治疗疗效的影响,为胃癌的治疗提供新的理论依据。材料和方法:（1）收集我科2019年11月-2021年6月期间接受内镜下PDT治疗的胃癌患者胃癌组织及外周血标本,对所有患者的临床资料记录并进行随访。以观察临床表型、实验室检测指标改变与预后之间的关系,通过单因素及多因素分析,对PDT干预后胃癌患者的生存获益及相关危险因素进行初步预测评估;（2）应用病理学方法检测PDT干预前后胃癌组织坏死、炎症水平的变化,同时检测外周血中炎症指标的变化。应用免疫组织化学染色法（IHC）、Western blotting检测危险信号DAMPs关键组成蛋白CRT、HMGB1在PDT干预前后胃癌组织中表达水平差异,同时检测T细胞及其亚型在PDT治疗前后胃癌组织内的表达变化;应用ELLSA检测PDT干预前后组织匀浆中IFN-γ水平的变化,应用流式细胞术检测PDT治疗前后胃癌患者外周血中免疫细胞的变化;应用Western blotting和荧光素酶-荧光素体系检测PDT干预前后胃癌细胞和培养基中DAMPs主要成分CRT、HMGB1和ATP的变化;（3）采用透射电镜、光镜观察细胞PDT干预后焦亡形态变化、Western blotting技术检测PDT干预细胞焦亡关键蛋白GSDMD水平变化。ELISA检测细胞焦亡后释放的炎症因子IL-1β、IL-18和LDH变化水平,通过以上三种方法确认焦亡。此外,应用Calcein-AM/PI活细胞或死细胞双染观察胃癌细胞AGS、MKN-45死亡情况。应用Western blotting检测胃癌和癌旁组织中焦亡标志蛋白GSDMD表达差异,同时检测GSDMD在正常胃细胞GES和不同胃癌细胞系MKN45、AGS、MKN28、HGC27、BGC-823、SG-7901、MKN-74表达水平;（4）体外实验中应用IHC检测PDT干预前后胃癌组织中焦亡及相关蛋白NLRP3、CAPS1、GSDMD在表达水平差异。利用荧光探针DCFH-DA检测和Western blotting技术检测PDT干预前后胃癌细胞焦亡经典激活通路ROS-NLRP3-CASP1-GSDMD中各关键蛋白质分子的表达水平变化和激活状态。利用特异性GSDMD sh RNA慢病毒下调胃癌细胞MKN45中GSDMD的表达,检测细胞死亡、焦亡水平变化。此外,PDT干预后分别使用ROS、NLRP3、CASP1的抑制剂NAC、MCC950、VX765预处理胃癌细胞,检测胃癌细胞死亡及焦亡变化情况;（5）使用GSDMD敲减胃癌细胞及对照组在裸鼠皮下成瘤,进一步分为PDT干预和非PDT干预组,通过比较PDT干预对裸鼠皮下肿瘤的大体观、体积及重量变化、焦亡关键蛋白GSDMD在肿瘤组织内表达,同时检测GSDMD下调对肿瘤局部组织坏死和急性炎症微环境变化。结果:（1）胃癌患者对光动力治疗耐受良好,具有较好的安全性;免疫治疗、单纯PDT、PDT联合免疫治疗晚期胃癌患者中位生存期（OS）分别为5.0、8.2、14.3个月,提示经PDT治疗可获较好的生存获益,PDT与免疫治疗有协同作用;进一步探讨PDT联合免疫治疗有较好获益的原因,发现PDT治疗可显著升高外周血白细胞、单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等细胞比例,诱发相应的炎症反应;同样,PDT干预后胃癌组织大片坏死、呈急性炎症改变,淋巴细胞浸润增多;（2）为了进一步探明PDT对免疫的影响,发现PDT干预后胃癌患者外周血中CD4+T和CD8+T细胞明显上调;同样的,PDT干预后胃癌组织内CD4+T和CD8+T细胞浸润明显增加;此外,PDT干预后组织匀浆中IFN-γ水平明显升高。综上PDT导致肿瘤组织急性炎症改变和淋巴细胞浸润增加,功能增强,提示适应免疫的激活。为了寻找适应免疫激活的原因,发现PDT干预后DAMPs关键组成蛋白CRT和HMGB1表达水平升高。综上,PDT干预后激活胃癌患者适应免疫激活和免疫原性死亡,与DAMPs水平升高相关,由此引起持久性的抗肿瘤作用;（3）发现GSDMD在胃癌组织及胃癌细胞株MKN-45、MKN-74、MKN-28、AGS、SGC-7901、BGC-823、MGC-803中低表达,而PDT干预后胃癌组织焦亡标志蛋白GSDMD表达明显升高;同样,对胃癌细胞MKN-45和AGS行PDT干预后,GSDMD蛋白表达水平也升高,激活态GSDMD-N蛋白升高更明显。为了明确焦亡的发生,在光镜下可见PDT干预后AGS、MKN-45胃癌细胞发生典型焦亡形态改变;透射电镜亦见PDT干预后胃癌细胞发生典型焦亡改变;此外,PDT干预12h后胃癌细胞AGS、MKN-45见普遍发生死亡;在PDT干预12h后,胃癌细胞AGS、MKN-45培养基中IL-1β、IL-18、LDH明显升高。说明PDT能够诱导胃癌细胞发生焦亡;（4）为了探明PDT诱导胃癌焦亡的激活通路,在PDT干预胃癌细胞MKN-45和AGS后12h,对经典激活通路进行ROS-NLRP3-CASPASE-1-GSDMD检测;发现核心蛋白NLRP3、caspase-1和GSDMD均升高,其中激活态Cleaved-caspase-1和GSDMD-N升高尤为明显;此外,ROS水平在胃癌细胞AGS、MKN-45中也明显升高;使用ROS抑制剂NAC,胃癌细胞MKN-45和AGS,在PDT干预12h后,细胞死亡水平下降明显,部分细胞存活,ROS降低明显,ROS、NLRP3、Cleaved-caspase-1和GSDMD-N的表达水平普遍降低,焦亡现象较对照组亦明显降低;使用NLRP3抑制剂MCC950,胃癌细胞MKN-45和AGS在PDT干预12h后,细胞死亡水平下降,但细胞死亡仍可见,ROS水平未见明显变化,NLRP3、Cleaved-caspase-1和GSDMD-N的表达水平普遍降低,焦亡现象较对照组降低;使用CASP1抑制剂VX765,胃癌细胞MKN-45和AGS在PDT干预12h后,细胞死亡水平降低,ROS、NLRP3水平未见明显变化,Cleaved-caspase-1和GSDMD-N表达水平降低,焦亡现象较对照组降低;此外,下调GSDMD表达,PDT干预12h,AGS、MKN-45胃癌细胞死亡水平下降,焦亡现象较对照组降低。综上,PDT通过ROS-NLRP3-CASPASE-1-GSDMD通路激活焦亡;（5）为了验证PDT通过GSDMD介导的焦亡诱导胃癌细胞表达DAMPs。首先发现PDT干预胃癌细胞MKN-45和AGS 12h后,DAPMs主要成员CRT、HMGB1的表达水平普遍升高,培养基中ATP水平升高明显,这与PDT干预后胃癌组织CRT、HMGB1、ATP升高结果一致。为了探讨GSDMD介导的焦亡对PDT诱导的DAMPs释放的影响,PDT干预靶向GSDMD慢病毒感染的MKN-45和AGS细胞12h后对DAMPs进行检测,与sh-Ctrl组相比,DAMPs核心成员CRT和HMGBI升高被抑制,培养基中ATP升高也被抑制。说明抑制GSDMD介导的焦亡可以影响PDT对DAMPs的产生和释放;（6）与sh-Ctrl组相比,sh-GSDMD组裸鼠皮下成瘤的体积和重量无明显区别,但是经PDT干预后sh-GSDMD组裸鼠皮下成瘤的体积增大、重量增加。结论:我们通过临床和相关的体内体外实验证明了:（1）胃癌患者对内镜下PDT治疗耐受良好,使用PDT治疗晚期胃癌患者可以明显改善患者的预后并与免疫治疗有协同作用;（2）PDT治疗后胃癌组织由原来的慢性炎症型改变成为对免疫治疗高应答率的急性“炎症型”。PDT治疗后胃癌组织内CD4+T和CD8+T的数量增加、功能激活,DAMPs表达升高;（3）GSDMD在胃癌细胞和胃癌组织中低表达;PDT可通过ROS-NLRP3-CASPASE-1-GSDMD通路诱导胃癌细胞发生焦亡,并诱导DAMPs的产生和释放。由此可见,PDT治疗后胃癌细胞发生焦亡,在直接杀伤肿瘤细胞的同时,释放炎症因子和DAMPs,形成有利于抗肿瘤免疫治疗应答的“炎症型”微环境,募集适应免疫细胞局部浸润和功能成熟,诱导免疫原性死亡,从而提高了抗肿瘤免疫治疗的疗效,改善胃癌患者的临床预后。