研究背景：血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)是中枢神经系统的重要结构,它对于维持中枢神经系统内环境的稳定具有极其重要的意义。BBB的存在,使中枢神经系统局部内环境成为区别于人体其他内环境的相对独立整体,从而保证中枢神经系统正常进行各项生理活动。目前认为,血脑屏障是由无窗孔的毛细血管内皮细胞及其间的紧密连接(tight junction, TJ)、星形胶质细胞足突、细胞基膜和周细胞共同组成的一个细胞复合体。在这个细胞复合体中主要的物质结构基础是毛细血管内皮细胞及其紧密相连,紧密连接结构相当稳定,主要起屏障和粘连作用,它与脑毛细血管内皮细胞组成血脑间物质交换的第一道屏障。在人体组织分布上,紧密连接各分子元件的表达有明显的组织特异性。这些表达不同的分子元件在人体内可以组装形成具有不同通透性功能的组织屏障进而适应不同组织器官的功能需要。在血脑屏障中,目前发现构成紧密连接的主要分子元件有：①跨膜蛋白claudin-5, claudin-1, occludin, JAM;②胞浆附属蛋白ZO-1, ZO-2, ZO-3,7H6与cingulin。而血脑屏障胞旁紧密连接通道功能(paracellular-tight junction channels, PTJC)、栅栏功能(fence function)等也被相继的发现。血脑屏障结构与功能的完整性对维持中枢神经系统的正常功能至关重要,同时,紧密连接结构与功能的变化也是多种神经系统疾病病理生理变化的核心过程。随着神经肿瘤学的发展,人们发现,胶质瘤细胞可以在其发生、发展过程中对血脑屏障产生多种作用进而导致多种神经系统症状及并发症的产生。胶质瘤细胞浸润、生长所导致的血脑屏障紧密连接的“破坏”是胶质瘤性脑水肿和癫痫等多种临床表现及并发症发生的主要原因之一脑胶质瘤是颅内发病率最高的原发性脑肿瘤,约占颅内肿瘤的40%左右。目前,即使采用手术、放疗、化疗等综合治疗,脑胶质瘤患者的平均五年生存率常不到30%。尽管近十年来,人们在脑胶质瘤的基础与临床研究方面都取得了很大的进步,但脑胶质瘤仍是致残率、致死率最高的恶性肿瘤之一。其中,作为胶质瘤最常见类型之一的胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM),其平均生存时间更在过去的三十年间无明显改善。但是,胶质瘤细胞如何引起中枢神经系统的多种病理生理变化?其分子机制如何?这是当前胶质瘤研究中的一个薄弱环节。除此之外,研究者们还发现,位于胶质瘤瘤周和瘤体内的血管内皮细胞及其间的紧密连接可以演变成一种特殊的“血瘤屏障”(blood-tumor barrier, BTB)。这一“屏障”的存在也是目前严重制约脑胶质瘤临床疗效的重要原因之一。长期以来,有关血脑屏障紧密连接在胶质瘤发生发展过程中的具体结构和功能变化及其机制一直不是十分清楚。对于血脑屏障紧密连接在脑胶质瘤中的形态学改变,许多文献叙述却不尽相同。而在胶质瘤对血脑屏障紧密连接的影响方面,不同的学者也取得了“开放”与“完整”的不同研究结果。为了研究胶质瘤细胞对血脑屏障的形态学改变,本研究通过分析21例人脑胶质瘤标本来探索胶质瘤细胞对血脑屏障的超微结构的影响；同时,随着现代分子生物学与实验技术的进步,如何从分子水平上阐明胶质瘤细胞对血脑屏障紧密连接的作用及其分子机制与病理生理意义已成为神经肿瘤学研究的当务之急。研究表明,在构成紧密连接的多种分子元件中,Claudins目前被认为是形成紧密连接超微结构、决定紧密连接屏障特性和离子通透特性的主要元件。Claudins是紧密连接复合体的主要跨膜蛋白,而Claudin-5是脑微血管内皮细胞间紧密连接中的主要黏附分子。目前研究表明,在构成紧密连接的多种分子元件中,Claudin-5是构成内皮细胞紧密连接的骨架蛋白,它参与维持紧密连接特有的栅栏功能和屏障功能,被认为是形成紧密连接超微结构、决定紧密连接屏障特性和离子通透性的主要元件,是紧密连接形成的必要条件。在很多神经系统疾病中,表达下降的Claudin-5已经被证明与血管通透性增加有着密切的关系。在小脑成血管母细胞瘤中,脑微血管内皮细胞Claudin-5表达的下降是其形成瘤囊的重要原因之一。为了研究脑胶质瘤血脑屏障紧密连接主要分子元件的表达变化,从分子水平上阐明胶质瘤细胞对血脑屏障紧密连接的影响及其可能的分子机制与病理生理意义,本研究利用免疫荧光双标及RT-PCR技术,探索了胶质瘤细胞对血脑屏障紧密连接分子元件Claudin-5的影响及其可能的分子机制。目的：1.研究脑胶质瘤血脑屏障内皮细胞间紧密连接超微结构的变化,为脑胶质瘤中血脑屏障的形态学改变提供理论基础。2.阐明血脑屏障内皮细胞间紧密连接结构的变化在胶质瘤发生、发展过程中的病理生理意义。3.研究脑胶质瘤血脑屏障紧密连接主要分子元件的表达变化,从分子水平上探索胶质瘤细胞对血脑屏障内皮细胞间紧密连接结构的变化及其可能的分子机制。方法：1.统计21例脑胶质瘤病例的一般情况,收集上述病例手术后切除的脑胶质瘤组织标本,并收集6例癫痫颞叶切除的颞极远隔部位标本作为正常脑组织对照组；把27例标本分为三组：正常脑组织组、低级别胶质瘤组与高级别胶质瘤组。2.采用透射电镜观察脑胶质瘤组织及正常脑组织血脑屏障内皮细胞间紧密连接的超微结构特征；3.运用免疫荧光双标染色观察脑胶质瘤组织及正常脑组织血脑屏障内皮细胞间紧密连接蛋白Claudin-5的表达；4.采用半定量RT-PCR的方法探索胶质瘤细胞对血脑屏障内皮细胞紧密连接蛋白分子元件Claudin-5表达的影响。5.统计学分析：采用SPSS13.0统计软件包分析。数据均以x±s表示,不同级别胶质瘤及正常组Claudin-5 mRNA条带OD比值比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用Bonferroni法,以P≤0.05为差异有显著性意义。结果：1.在透射电镜下,正常脑组织微血管相邻内皮细胞间可见连续条带状的紧密连接,细胞间未见裂隙；在低级别胶质瘤中,多数微血管内皮细胞间可见连续的紧密连接,未见明显窗口形成；在高级别胶质瘤中,微血管内皮细胞间紧密连接破坏严重,内皮细胞间可见明显裂隙,在局部还可见残存的紧密连接,部分内皮细胞间连接为缝隙连接,内皮细胞上偶见窗口形成,胞浆中吞饮小泡明显增多,尤以多形性胶质母细胞瘤为著,内皮基膜局部有虫蚀状空洞形成。2.免疫荧光双标染色观察在正常脑组织中,微血管内皮细胞上可见大量Claudin-5表达；在低级别胶质瘤中,微血管内皮细胞上Claudin-5的表达略降低；在高级别胶质瘤中,微血管内皮细胞上无明显Claudin-5的表达。3.PCR结果显示,正常脑组织、低级别胶质瘤、高级别胶质瘤Claudin-5 mRNA表达的相对强度分别为：0.633±0.068、0.519±0.172、0.227±0.148；经比较,高级别胶质瘤Claudin-5 mRNA与正常脑组织、低级别胶质瘤差别有统计学意义(F=17.283,P=0.000),但正常脑组织与低级别胶质瘤Claudin-5 mRNA的表达水平差别无统计学意义(P>0.05)结论：1.胶质瘤细胞在其发生、发展过程中通过与血脑屏障内皮细胞的相互作用破坏血脑屏障内皮细胞间紧密连接超微结构。2.在不同级别脑胶质瘤组织中,血脑屏障紧密连接受破坏的程度不同,脑胶质瘤的级别越高,血脑屏障紧密连接完整性受破坏的程度越大。3.在不同级别脑胶质瘤中,胶质瘤细胞能通过多种途径降低血脑屏障内皮细胞紧密连接蛋白Claudin-5的表达。胶质瘤级别越高血脑屏障内皮细胞间紧密连接蛋白Claudin-5的表达越低。血脑屏障内皮细胞间紧密连接蛋白Claudin-5这一分子元件的表达下降可能是血脑屏障内皮细胞间紧密连接结构受到破坏的重要原因。