新型鸭正呼肠孤病毒的分离与鉴定

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近年来,我国多处肉鸭养殖场发生一种以跗关节肿大、患鸭站立不稳以及生长发育受阻为特征的传染性疾病。剖检发现关节肿胀处化脓出血,肌腱断裂;肝脏肿大、出血以及有坏死灶、脾脏不规则坏死。根据该病的临床症状初步怀疑是由新型鸭正呼肠孤病毒(Novel duck orthoreovirus,N-DRV)引起,但又不完全相同于鸭“脾坏死”病。本研究从山东临沂某肉鸭养殖场患鸭关节、肝脏和脾脏中进行病原分离,经病毒增殖、序列测定和全基因组测序等分离到一株N-DRV,命名为LY20,通过回归动物实验了解该毒株的病死率、临床表现和排毒规律等,为防控N-DRV提供了理论依据。本研究对疑似N-DRV感染的鸭肌腱和内脏通过鸡胚肝细胞进行病毒的分离,细胞经病毒感染后出现了以细胞融合为特征的病变,符合N-DRV的病变特征。收取细胞毒经RT-PCR检测和σC测序发现该病毒与N-DRV参考株XT18株的核苷酸同源性为98.9%,并对其进行全基因组序列分析。结果显示,LY20株全基因组序列23419 bp,共10个小节段。同源性分析结果显示,LY20株各节段均与N-DRV同源性最高。与N-DRV参考株XT18株亲缘性最近,L2、L3、M2、M3、S1、S3基因与其同源性最高(nt:98.3%~99.6%;aa:97~99.7%);M1基因是所有节段中同源性最低的,与N-DRV参考株HN5d株为(nt:97.5%;aa:94.2%)。S1基因同源性比对结果显示,LY20株与MDRV和ARV同源性不高,与ARV参考株S1133株同源性为(nt:45.2%;aa:11.3%),与MDRV参考株815-12株的同源性为(nt:33.4%;aa:14.5%)。σC基因同源性比对结果显示,与MDRV参考株815-12株的同源性为(nt:49.6%;aa:42.2%),高于与ARV参考株S1133株的同源性(nt:39.6%;aa:28.3%)。遗传进化分析结果显示,LY20株各基因组节段均处于N-DRV分支,在L1、L2、L3、M1、M3、S2、S4基因遗传进化分析树中,N-DRV与MDRV亲缘关系更近,ARV处于一个单独的大分支;在M2、S1、S3基因的遗传进化分析树中,N-DRV与ARV亲缘关系更近,MDRV处于单独的进化分支。S1基因遗传进化分析结果显示,N-DRV与MDRV和ARV分别处于不同的分支,与ARV遗传进化关系较近,离MDRV较远。σC基因遗传进化树中,N-DRV与MDRV遗传进化关系较近,与ARV较远。将120只1日龄健康樱桃谷鸭随机分为四组,每组各30只,A组为脚垫攻毒组、B组为肌肉攻毒组、C组为口服攻毒组、D组为对照组。攻毒组每只接种0.2 m L(TCID50为10-5.8/0.1m L)病毒液,对照组每只接种0.2 m L生理盐水。每日观察临床症状,于攻毒后1dpi、3 dpi、5 dpi、7 dpi、10 dpi、14 dpi、18 dpi、22 dpi随机抽取3只称重记录,采集泄殖腔棉拭子、采血并分离血清,随后进行剖杀,采集肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、法氏囊、胸腺、肌腱等组织器官,进行病毒载量的检测。攻毒组肉鸭的主要临床症状为精神沉郁,生长发育缓慢,关节出现肿胀,严重的出现瘫痪,脚垫攻毒组症状最为明显。剖检症状为肝脏出血、坏死,脾脏严重坏死,法氏囊肿大,胸腺出血,少数攻毒组肉鸭出现了肺脏出血、坏死,肾脏肿大出血。股骨头变形,皮下出血,关节腔内化脓、淤血,有棕红色黏液渗出。其中脚垫攻毒组症状最严重,肌肉攻毒组次之,口服攻毒组症状较轻。体重检测数据显示,各攻毒组均体重增长缓慢,脚垫攻毒组最为显著。组织病毒载量检测结果显示,在所采集组织中均能检测到病毒,其中脾脏和法氏囊中病毒载量较高。血液排毒规律显示,攻毒后1 d可在血液中检测到病毒,3~5dpi达到高峰,14 dpi出现第二个高峰。棉拭子排毒规律显示,攻毒组在感染早期排毒量较高。抗体水平检测结果显示,攻毒组抗体水平均高于对照组。以上实验结果表明,人工感染LY20株后可引起肉鸭病毒性关节炎、肝脏和脾脏坏死及生长抑制。
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