本实验室前期研究表明,60%乙醇沉淀的马尾松花粉多糖经硫酸酯化后能促进小鼠脾淋巴细胞内钙离子浓度的升高,其升高的途径至少有三种:通过膜表面的L-型钙离子通道引发CICR;通过内质网膜上IP3R介导的内钙释放;通过膜上钙库调控的钙通道调节。但是,硫酸酯化多糖作为一种分子量很大的化合物如何作用于细胞,引起细胞内钙离子浓度的变化,目前尚不清楚。本实验拟从体外的角度,对硫酸酯化马尾松花粉多糖引起小鼠脾淋巴细胞内钙离子升高的机理进行初步探讨,并对其产生细胞因子的影响进行初步研究,明确硫酸酯化对松花粉多糖体外免疫增强作用的机理,以期为马尾松花粉多糖的开发利用提供理论支持。实验主要分为以下几个部分。一、60%乙醇沉淀的马尾松花粉多糖（PPM60）的提取、纯化及硫酸酯化:采用水煮醇沉法提取马尾松花粉粗多糖,用Savage法重复几次去除蛋白质,用终浓度为40%、60%、80%乙醇分级沉淀,干燥称重。选取60%乙醇沉淀组分用Sephacryl S-400HR对多糖进行分离纯化及分子量测定,分离出三个组分,PPM60-A、PPM60-B、PPM60-C其分子量为1.44×10⁵、1.2×10⁵、7.26×10⁴Dalton。对100mg PPM60进行硫酸酯化修饰,得到暗黄色产物（SPPM60）128 mg。用氯化钡-明胶比浊法测定取代度为1.2264。红外光谱显示已具有C-O-S和S=O的特征吸收峰,表明多糖已被成功硫酸酯化。二、SPPM60对小鼠脾细胞增殖能力的影响:MTT法检测不同浓度SPPM60和PPM60作用不同时间对小鼠脾细胞增殖活力的影响。SPPM60在200μg/mL浓度下作用48h对小鼠脾细胞的促增殖率最高,达18.29%。而PPM60对小鼠脾细胞增殖作用较弱。经SPPM60（200μg/mL）处理72 h后,细胞增殖速度显著减慢。对于分离的三个组分及其酯化物,PPM60-A酯化后其促增殖能力最强,比酯化前增加了10.84%。三、SPPM60对小鼠脾脏淋巴细胞内游离钙离子浓度([Ca²⁺]_i)的影响:以Fura-2/AM为探针,荧光分光光度计检测SPPM60处理后[Ca²⁺]_i的变化。SPPM60-A作用5 min内,SPPM60-A组[Ca²⁺]_i与对照组相比均显著性升高。而TLR4的抑制剂TAK-242加入后再加SPPM60-A刺激,小鼠脾脏淋巴细胞内[Ca²⁺]_i较单独SPPM60-A组有显著性降低,但未降到空白对照水平。LY294002（PI3K的抑制剂）能部分抑制SPPM60-A引起的小鼠脾脏淋巴细胞内[Ca²⁺]_i升高。此外PLC的抑制剂U73122能完全抑制SPPM60-A引起的小鼠脾脏淋巴细胞内[Ca²⁺]_i升高。四、PPM60及SPPM60对小鼠脾脏淋巴细胞分泌细胞因子的影响:用酶联免疫吸附实验法检测SPPM60或PPM60刺激后脾细胞培养上清中IL-2、IL-4的表达。结果SPPM60在200μg/mL条件下刺激48小时,脾细胞培养上清中IL-2、IL-4的产生均有所升高,而加入TLR4的抑制剂TAK-242后,再加SPPM60刺激,IL-2、IL-4的产生与空白对照相比没有显著性变化。PPM60对IL-2、IL-4的产生几乎没有影响。以上结果表明:（1）PPM60对小鼠脾脏淋巴细胞有较弱的增殖作用,硫酸酯化以后产生显著性的促增殖作用。（2）SPPM60促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖可能是通过提高细胞内游离钙离子浓度来实现的。（3）SPPM60促进小鼠脾脏淋巴细胞[Ca²⁺]_i升高与TLR4-PI3K-PLC信号通路有关。（4）SPPM60促进小鼠脾脏淋巴细胞培养上清中IL-2、IL-4的产生是通过TLR4发挥作用的。