一、背景胰腺癌是恶性程度最高、侵袭性最强、预后最差的肿瘤之一，全球发病率逐年递增，五年生存率仅为4%左右。虽然经过广大科研和临床工作者不懈的努力，在胰腺癌的诊断、治疗以及预测等方面取得了较大的提高，但手术、化疗、放疗的疗效仍不理想，术后五年存活率不足15%。究其原因，是因为胰腺癌早期无明显相关临床特征，大多数患者被诊断为胰腺癌时已处于中期或晚期，仅约20%的患者能接受胰腺癌根治术(即：胰十二指肠切除术，Wipple手术)治疗。因此，当前迫切需要开发新的诊断和治疗策略。目前，研究发现表观遗传学改变(如：microRNAs)对于癌症的发生、发展非常重要。miRNAs是一类非编码RNA(长度约为21-23单核苷酸)，能通过靶向作用于mRNA3’非翻译区，触发翻译抑制或RNA降解从而调节基因表达。miRNAs可调节约30%人类基因。越来越多的证据表明许多miRNAs与多种肿瘤的发生密切相关，其表达方式可能具有疾病特异性以及对于特定肿瘤组织分类具有重要作用。Bmi-1是转录抑制子PcG家族中一重要成员。胚胎时期，对于维持造血干细胞自我更新和神经干细胞增殖活性发挥着重要作用。许多报道提示：Bmi-1过表达于多种恶性肿瘤中，如：非小细胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌以及子宫内膜癌等。而胰腺癌中，Bmi-1也明显过度表达，且与组织学分级和临床分期关系密切。同时，研究发现卵巢癌和子宫内膜癌患者中Bmi-1过度表达的，其生存时间明显降低、较早发生淋巴结转移。因此，胰腺癌中Bmi-1可能发挥着重要的致癌作用。同时，文献提示：Bmi-1可直接调节上皮间质转化(EMT)过程而EMT已被证实是促进肿瘤转移的关键步骤，EMT过程的发生能明显地增加肿瘤细胞的侵袭能力，而上皮间质转化过程发生的标志则是E-钙黏蛋白(E-cadherin)的减少或缺失。Bmi-1调节过程十分复杂，研究指出Bmi-1在多种肿瘤中可被不同的miRNAs所调节(如：miR-15a, miR-16, miR-128, miR-194, miR-302, and miR-200c)。因此，我们推测被表观遗传学改变(如：miRNAs)所介导的Bmi-1的表达可促进胰腺癌的发生、发展，而该推测目前尚未见报道。为了全面研究胰腺癌中， miRNAs是否调节以及如何调节Bmi-1的表达。综合近年来国内外与此相关的研究结果，我们提出了如下实验假设：胰腺癌中，miRNAs表达改变后导致Bmi-1过表达，从而促进胰腺癌细胞增殖和上皮间质转化过程的发生。显然，如果我们能对该实验设想加以验证，将有助于开发新的预防和治疗策略。二、目的本研究我们拟在探究miRNAs是否可通过下调Bmi-1表达从而抑制胰腺癌细胞增殖以及上皮间质转化的发生，以及如何调节。为最终建立一个可应用于临床的新的治疗策略提供参考。三、方法和结果1.检测胰腺癌和正常胰腺组织中microRNAs表达情况。取新鲜胰腺癌组织(n=43例)和正常胰腺组织(n=20例)，在保持冷冻条件下，用捻钵将组织磨成粉状，提取总RNA。采用Real-Time PCR检测miRNAs表达情况。在所检测的6种miRNAs中，仅miR-15a在胰腺癌组织中的表达水平明显低于正常胰腺组织。我们还发现在胰腺癌组织中，miR-16在胰腺癌组织和正常胰腺组织中未见明显变化，成为一很好的对照miRNA。2.测定胰腺癌和正常胰腺组织中Bmi-1表达情况以及明确miR-15a与其关系。取胰腺癌和正常胰腺组织石蜡切片，采用免疫组织化学的方法检测Bmi-1分别在其中的表达情况；培养胰腺癌细胞株PANC-1，采用脂质体转染法将miR-15a转入胰腺癌细胞株PANC-1和空白对照组中，72小时后提取总蛋白并采用western immunoblotanalysis测定Bmi-1表达变化情况，明确其与miR-15a的关系；同时，分析Bmi-1与患者临床病理特征以及生存时间的关系。Bmi-1明显过度表达于胰腺癌组织中，而在正常胰腺组织以及阴性对照组中未见表达；与空白对照组相比，转染miR-15a后Bmi-1表达量明显降低，二者呈负性相关；胰腺癌中，Bmi-1与多种临床病理特征以及患者生存时间密切相关。3.明确miR-15a/Bmi-1对胰腺癌细胞增殖和上皮间质转化的影响培养胰腺癌细胞株PANC-1，采用脂质体细胞转染、质粒转染、western immunoblotanalysis、细胞增殖测定(CCK-8)等方法检测胰腺癌细胞增殖和上皮间质转化的情况。当胰腺癌细胞株PANC-1转染miR-15a后，Bmi-1明显下调，同时胰腺癌细胞增殖以及上皮间质转化均受到抑制；将含有Bmi-1gene的质粒载体转导进入已转染了miR-15a的胰腺癌细胞株PANC-1中，对上述实验结果进行回补验证，胰腺癌细胞增殖增加和E-钙黏蛋白降低，反向证明了miR-15a下调Bmi-1表达后抑制胰腺癌细胞增殖和上调E-钙黏蛋白这一实验结果的可靠性。四、结论1. miR-15a在胰腺癌组织中的表达水平明显低于正常胰腺组织；miR-16在胰腺癌和正常胰腺组织中表达未见明显差异，是一很好的对照miRNA。2. Bmi-1明显过度表达于胰腺癌组织中且主要表达在细胞核中，偶有表达于细胞质中，而在正常胰腺组织以及阴性对照组中未见表达；miR-15a与Bmi-1二者呈负性相关；Bmi-1与组织学分级、临床分期、生存时间密切相关。3. miR-15a通过下调Bmi-1表达从而抑制胰腺癌细胞增殖和EMT过程的发生。