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目的本实验通过研究麻黄细辛附子汤对AR经典病机Th1/Th2失衡相关的2个主要靶点(CD4~+T细胞增殖分化及DCs诱导初始T细胞偏移)的作用,试分析麻黄细辛附子汤的免疫调节机制与抗炎的机理。方法1.建立DCs与T细胞培养的方法,培养DCs,T细胞。2.制备麻黄细辛附子汤水提液,用CCK-8检测麻黄细辛附子汤对DCs与T细胞的毒性。3.流式检测麻黄细辛附子汤水提液对体外活化的CD4~+T细胞增殖分化的影响。4.流式检测麻黄细辛附子汤干预LPS刺激DCs后,DCs的成熟情况。5.流式检测麻黄细辛附子汤干预TSLP刺激DCs后,DCs的成熟情况。6.AimPlex流式高通量多因子检测麻黄细辛附子汤干预LPS刺激DCs后细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、IFN-γ的含量。7.AimPlex流式高通量多因子检测麻黄细辛附子汤干预TSLP刺激的DCs诱导T细胞分泌细胞因子IL-5、IL-13的含量。8.Western-Blot检测麻黄细辛附子汤干预LPS刺激DCs后STAT6与STAT5的磷酸化水平。9.qPCR检测麻黄细辛附子汤干预LPS刺激DCs后T-bet mRNA与GATA-3 mRNA的表达。结果1.成功建立DCs与T细胞原代细胞培养的方法。2.CCK-8检测麻黄细辛附子汤对T细胞活性影响可知,麻黄细辛附子汤浓度达20mg/ml时,T细胞活性增强(P<0.01),麻黄细辛附子汤水提液浓度进一步增大时,细胞活力也进一步增强。但在显微镜下观察T细胞状态后发现,中药组细胞较正常组细胞稀疏,与CCK-8检测结果不符,经流式检测可知,麻黄细辛附子汤浓度在10mg/ml时,对T细胞的形态已经产生较大的影响。CCK-8检测可知,浓度在5mg/ml以内的麻黄细辛附子汤干预DCs后不影响细胞活性,反而促进细胞活性(P<0.01);浓度在5mg/ml时CCK-8检测细胞活性最高,当药物浓度达10mg/ml时,细胞活性虽然高于正常组,但出现下降趋势,麻黄细辛附子汤对DCs的活性已经出现抑制。而药物浓度达到40mg/ml时,细胞活性虽然与正常组无差异,但DCs的活性较其他组明显下降较,药物毒性显著。3.未活化组(C)、活化组(A)与麻黄细辛附子汤干预组(M)CD4~+T细胞的增殖均与初始标准组(S)有差异(P<0.01)。其中,活化组(A)增殖情况强于未活化组(C),P<0.01;麻黄细辛附子汤干预组(M)CD4~+T细胞的增殖情况强于未活化组(C)与活化组(A),P<0.01。活化组(A)中IFN-γ~+CD4~+T细胞与IL-4~+CD4~+T细胞均高于空白组(C),p<0.01;麻黄细辛附子汤干预组(M)IFN-y~+CD4~+T细胞的比例高于未活化组(C),p<0.01,而与活化组(A)差异不明显;IL-4~+CD4~+T细胞的比例高于未活化组(C),P<0.01,但较活化组(A)降低,P<0.01。4.LPS干预组中CD80~+DCs、MHCⅡ~+DCs与CD83~+DCs的比例均高于空白对照组(P<0.01);麻黄细辛附子汤干预组中CD80~+DCs、MHCⅡ~+DCs与CD83~+DCs的比例均低于LPS干预组(P<0.01),且MHCⅡ~+DCs与CD83~+DCs的比例与空白对照组相比无明显差异,但CD80~+DCs的比例仍较空白对照组高(P<0.01)。5.空白对照组、TSLP干预组与麻黄细辛附子汤干预组三组中,CD80~+DCs、MHCⅡ~+DCs与CD83~+DCs的比例均无明显差异。6.LPS干预组(L组)IL-12、IFN-γ、IL-6、IL-1β的表达均较空白对照组(C组)升高(p<0.01);麻黄细辛附子汤干预组(M组)IL-12、IFN-γ、IL-6、IL-1β的表达较LPS干预组(L组)均下降(p<0.01),但仍较空白对照组(C组)增高(P<0.01)。7.TSLP干预组(T组)T细胞分泌细胞因子IL-5、IL-13的表达均较空白对照组(C组)升高(p<0.01);麻黄细辛附子汤干预组(M组)T细胞分泌细胞因子IL-5、IL-13的表达较空白对照组(C组)增高(P<0.01),但与TSLP干预组(T组)相比无明显差异。8.LPS干预组(L组)STAT6的表达较空白对照组(C组)下降(p<0.05),麻黄细辛附子汤干预组(M组)STAT6的表达较空白对照组(C组)与LPS干预组(L组)均下降(p<0.01;p<0.05);LPS干预组(L组)pSTAT6的表达较空白对照组(C组)下降(p<0.01),麻黄细辛附子汤干预组(M组)STAT6的表达较LPS干预组(L组)升高(p<0.01)与空白对照组(C组)无明显差异。LPS干预组(L组)PSTAT6/STAT6较空白对照组(C组)下降(p<0.05);而麻黄细辛附子汤干预组(M组)PSTAT6/STAT6较空白对照组(C组)与LPS干预组(L组)均升高(p<0.05;P<0.01)。LPS干预组(L组)、空白对照组(C组)与麻黄细辛附子汤干预组(M组)三组DCs中STAT5的表达均无明显差异;LPS干预组(L组)pSTAT5的表达较空白对照组(C组)降低(p<0.01),麻黄细辛附子汤干预组(M组)pSTAT5的表达较空白对照组(C组)降低(p<0.01)但与LPS干预组(L组)无明显差异。LPS干预组(L组)pSTAT5/STAT5较空白对照组(C组)降低(p<0.05),麻黄细辛附子汤干预组(M组)pSTAT5/STAT5较空白对照组(C组)降低(p<0.05),但与LPS干预组(L组)无明显差异。9.T-bet与GATA-3分别为Th1与Th2型细胞特异性的转录因子。LPS刺激DCs后,LPS干预组(L组)T-betmRNA表达较空白对照组(C组)增多(p<0.05),而麻黄细辛附子汤干预组(M group)T-bet mRNA表达量较空白对照组(C组)与LPS干预组(L组)均明显降低(p<0.01);LPS干预组(L组)GATA-3 mRNA的表达较空白对照组(C组)无明显差异,而麻黄细辛附子汤干预组(M group)GATA-3 mRNA的含量较空白对照组(C组)与LPS干预组(L组)均升高(p<0.01,p<0.05)无明显差异。结论1、本实验成功建立了原代培养DCs与T细胞两种细胞培养的方法。2、临床常用剂量的麻黄细辛附子汤对DCs与T细胞的毒性很小。3、麻黄细辛附子汤能促进体外活化的T细胞增殖并能减少其IL-4的分泌,促进使机体免疫功能,调控Th1/Th2的分化,可对AR发挥疗效。4、麻黄细辛附子汤能抑制LPS刺激DCs后DCs表明成熟分子的表达,具有抑制DCs抗原提呈的能力,可发挥抗炎作用。5、TSLP刺激DCs后,对DCs表面特异性成熟分子作用不明显,几乎无诱导DCs成熟的作用,而麻黄细辛附子汤也对TSLP刺激DCs后细胞的成熟状态无明显作用。6、麻黄细辛附子汤可下调LPS刺激DCs后,抑制促炎因子IL-12、IFN-γ、IL-6、IL-1β的分泌,具有明显的抗炎功效。7、麻黄细辛附子汤不能下调TSLP刺激DCs后诱导T细胞分泌细胞因子IL-5与IL-13的含量,对TSLP刺激DCs后引起的Th2型细胞因子分泌无明显的调节作用。8、麻黄细辛附子汤可升高LPS刺激DCs后STAT6磷酸化水平,具有调节Th1失衡的潜力;但麻黄细辛附子汤不能逆转LPS刺激后DCs中STAT5磷酸化水平的下降,因而STAT5不是麻黄细辛附子汤调控Th1炎症的作用靶点。9、麻黄细辛附子汤可抑制LPS刺激DCs后T-betmRNA的表达,并使GATA-3 mRNA表达上调,通过STAT6-GATA-3路径实现对Th1分化偏移的调控。