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基因打靶是通过同源重组对DNA序列特定位点进行精确修饰的技术,是基因功能分析和基因治疗等应用的技术基础。CRISPR-Cas9等人工核酸酶技术能特异性的切割基因组DNA产生双链断裂(DSB),诱导细胞内源修复机制进行同源重组(HR)修复或非同源末端连接(NHEJ)修复。基因组的精确编辑是通过同源重组(HR)方式精确插入、删除、替换某一特定DNA片段实现的,同源重组在大多数生物体内的效率都很低,HR相对NHEJ的低效率大大限制了基因组靶向修饰的应用。因此,提高同源重组修复效率对基因靶向修饰应用意义重大。本研究将能够高效特异切割基因组DNA序列的CRISPR-Cas9核酸酶和能与特定DNA序列(UAS)结合的酵母转录激活因子Gal4的DNA结合域Gal4BD融合表达。Cas9在导向RNA(sgRNA)的引导下切割基因组特定位点,产生DNA双链断裂,与此同时,与Cas9融合表达的Gal4BD与5’端含有其特定结合序列(UAS)的同源重组修复供体结合,将同时含有双链断裂切口两侧同源序列的同源重组供体导向至双链断裂位点进行同源重组修复。我们期待借助Gal4BD与供体所含UAS之间的结合力,拉近供体与双链切口的空间距离,从而提高同源重组修复效率。首先应用piggy bac转座系统将嘌呤霉素筛选基因和打断的绿色荧光报告基因随机整合至人类胚胎肾细胞(HEK-293T)细胞基因组,应用嘌呤霉素(Puromycin)筛选十天获得整合阳性细胞池,挑取细胞单克隆获得整合型报告细胞系。构建Gal4BDCas9融合表达载体,设计合适的引物PCR扩增得到HR供体,该双链供体5’端含有与Gal4BD特异结合的DNA序列(UAS),剩余部分为基因组双链断裂切口两侧的同源序列。本研究使用含有不同长度同源序列的供体,以探究同源序列长度对同源重组修复效率的影响。将Gal4BD-Cas9融合表达载体与PCR扩增所得供体共转染至HEK-293T报告细胞系,显微镜下统计绿色荧光细胞数,计算同源重组修复效率。研究结果表明,在一定范围内,同源重组修复效率随供体同源序列长度增加而提高;当供体所含同源序列长度不同时,借助Gal4BD与供体所含UAS之间的结合力拉近供体与双链切口的空间距离,对同源重组修复的促进作用不同。结果表明当供体所含报告基因同源序列为60bp时,Gal4BD-Cas9系统对同源重组修复提高作用最明显,同源重组修复效率较对照组提高了四倍。PCR扩增所得供体为双链DNA序列,在细胞和生物体内具有更高的稳定性,与化学合成单链寡核苷酸受到长度限制和载体构建过程复杂的不足相比,通过PCR扩增的方式获得供体更加经济、高效。这项研究为提高基因打靶效率提供了新的概念,为未来基因组靶向修饰研究开拓了新的方向,为基因靶向修饰技术应用于动物遗传育种与动物疾病基因治疗提供了新的技术基础。