旱柳半胱氨酸蛋白酶基因克隆及盐胁迫响应功能分析

来源 :三峡大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zkc19890314
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旱柳是一种耐盐耐旱的植物。本文以旱柳为材料,采用生物信息学、RT-qPCR、基因克隆等技术,得到了旱柳SmCP基因cDNA及基因组全长,分析其基因功能,得出结论如下:  1)从旱柳cDNA文库中筛选出一个耐盐相关的半胱氨酸蛋白酶基因,通过PCR克隆获得旱柳SmCP基因cDNA全长和基因组DNA全长。生物信息学软件分析得知该基因含有8个外显子,7个内含子,编码359个氨基酸。同时该蛋白具有木瓜蛋白酶家族保守的结构域:inhibitor-I29和peptidase-C1A,与其他木瓜蛋白酶家族一样,N末端有1个信号肽结构,同时还有1个跨膜结构,属于跨膜蛋白。  2)亚细胞定位预测显示该基因位于液泡中;进化树分析表明该基因与毛果杨PtCP亲缘关系最近。启动子元件预测显示该基因启动子区包含热胁迫、干旱胁迫、抗氧化响应元件HSE、MBS、ARE,同时还含有茉莉酸甲酯、水杨酸、生长素、赤霉素响应元件MeJA、TCA-element、TGA-element、TATC-box,表明SmCP极有可能参与了这些逆境胁迫的响应。  3)分别提取不同盐处理时间旱柳的根茎叶的RNA,利用RT-qPCR进行旱柳SmCP组织特异性时空表达模式分析。结果显示SmCP在旱柳根茎叶中都有表达,在叶中表达量最高,根和茎中表达量差异不大。在盐胁迫的96小时的过程中,SmCP在根茎叶中动态表达的。茎中表达趋势不明显,在叶中,胁迫24h的过程中,SmCP表达量逐渐升高,24h达到巅峰值,随后下降。在根中,表达量在48h时急剧升高,在96h表达量是0h的8倍左右。  4)构建SmCP的原核表达载体pYES2.1-SmCP,转化大肠杆菌BL21 Star(DE3),1M NaCl胁迫条件下进行点板实验及绘制生长曲线,结果显示SmCP基因的转化子生长状态都优于空载,证明SmCP的导入提高了大肠杆菌耐盐性。  5)构建的植物表达载体pCAMBIA2300-SmCP转化农杆菌,侵染拟南芥,鉴定得到阳性表达植株。随后对转基因植株及野生型拟南芥盐胁迫处理,观察表型和测定生理指标,结果表明,盐胁迫后,转基因拟南芥生长状态优于野生型拟南芥。非损伤微测技术显示转基因拟南芥胁迫后Na+外排,H+内流速度都明显高于野生型。转录组分析结果显示外源基因SmCP可能通过延缓衰老,增强细胞耐渗透性来增加拟南芥的耐盐性。
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