水稻种子休眠性基因qSD7-1的精细定位和转录组分析

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水稻种子休眠性与穗发芽抗性和种子的安全贮藏密切相关,同时也严重影响着水稻的产量和稻米品质。因此,研究水稻种子休眠性的遗传基础对培育适度休眠性的水稻优良品种、保障种子生产和贮藏安全均具有重要现实意义。本研究通过单片段代换系(W22S)与受体亲本“华粳籼74”(W0)杂交构建F2分离群体,并进一步发展次级单片段代换系,对水稻种子休眠性新基因qSD7-1进行精细定位和候选基因的初步研究,同时进行相关的转录组分析,获得了以下主要研究结果:1、利用供体亲本为Khazar的单片段代换系W22S与受体亲本“华粳籼74”(W0)杂交的F2分离群体中含有目标基因的合适单株自交产生F3群体;采用分子标记辅助选择从中筛选到了8份不同代换片段长度的次级单片段代换系,利用重叠群代换作图的方法将水稻种子休眠性新基因qSD7-1定位于LCB14--LCB15-UI174--LCB5约48.9 kb的范围,该区间存在9个候选基因。2、利用对照W0与单片段代换系W22S材料对目标区间的9个候选基因进行实时荧光定量表达实验,其中ORF1、ORF3、ORF6、ORF8和ORF9在种子发育过程中的整体表达量均较高,且在W0和W22S两个材料的发育后期中,其相对表达量差异均达到极显著水平;同时在发育后期剑叶和枝梗的定量表达实验中,ORF1、ORF3与ORF8的表达量相对较高且差异极显著,而ORF6和ORF9在剑叶与枝梗中表达量很低,因此初步推测ORF1、ORF3、ORF6、ORF8和ORF9为可能的目标候选基因,且不同候选基因在不同组织中的表达模式不一致。3、利用对照W0与单片段代换系W22S材料对目标区间的9个候选基因进行测序,发现除ORF1和ORF6外,其余均未在两个材料间发现序列上的差异。其中与W0相比,来自单片段代换系W22S的ORF1在第1内含子317-318 bp处有两个AT碱基缺失,在第2、8和9外显子上存在单碱基的突变,但均为同义突变,未发生氨基酸变化;ORF6的编码区在W0和W22S存在一个C/T的单碱基突变,会引起氨基酸从精氨酸变为色氨酸,而色氨酸是植物内生长素合成的重要前体物质,同时ORF6含有F-Box蛋白家族,这类蛋白家族成员在植物激素(尤其是GA和ABA)的信号转导和糖代谢等过程中有重要功能,与种子萌发和休眠密切相关,同时对来源不同的单片段代换系进行测序发现ORF6在C/T处的突变与水稻种子休眠性高度相关,即突变位点为T的种子休眠性较强,而突变位点为C的休眠性较弱,因此推测ORF6为目标候选基因。4、利用4份供体来源不同的单片段代换系对qSD7-1进行等位基因变异分析,结果在不同材料间发现3种等位基因类型,其种子休眠性由强到弱分别依次为qSD7-11、qSD7-12、qSD7-13。5、对抽穗30 d的单片段代换系W22S和“华粳籼74”(W0)进行转录组测序,共检测到59个差异基因,其中上调基因14个,下调基因45个;转录组差异基因的注释表明这些差异基因主要参与了亚麻油酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、糖酵解途径等次级代谢物的生物合成过程,推测qSD7-1基因调控种子休眠的方式可能与次级代谢物如糖类、氨基酸等有关。本研究对水稻种子休眠性基因qSD7-1进行了精细定位,并对其候选基因进行了测序和定量表达分析,鉴定出具有不同遗传效应的等位基因,进一步明确了水稻种子休眠性的遗传基础,为水稻种子休眠性基因qSD7-1的克隆及种子休眠性的分子设计育种奠定了基础。
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