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本论文包括两个部分:猪抑制素α亚基成熟肽的真核表达及主动免疫IHN与卵泡抑素对种猪繁殖性能的影响。
第一部分为蓝塘猪抑制素α亚基成熟肽的真核表达载体的构建和在毕赤酵母中的表达。本试验应用DNASTAR基因分析软件,参照本实验室原先克隆的猪抑制素α亚基成熟肽的cDNA序列,设计合成了一对引物,上游引物P1在其5端加入了EcoR Ⅰ限制性内切酶位点;下游引物P2在5端加入了Kpn Ⅰ限制性内切酶位点。应用PCR技术将特异性引物P1/P2进行扩增,得到目的基因片段为417bp的猪抑制素α亚基成熟肽基因。将所得到的目的片断与连接载体pMD18-T连接,经过转化,挑选阳性克隆菌进行PCR鉴定结果正确。将pMD-IHNα与表达载体pPICZαC分别经过EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ同步双酶切,然后连接转化大肠杆菌,得到重组表达质粒pPICZαC-IHNα,测序结果显示目的基因片段正确插入表达载体pPICZαC中。
重组表达质粒pPICZαC-IHNα经Sac Ⅰ单酶切后电泳纯化回收,电击转化感受态毕赤酵母工程菌X-33,涂布YPDS+ZeocinTM选择性培养基,置28℃培养4~5天,获得多个单菌落,筛选出具高抗性的转化子。进行诱导表达,用甲醇诱导表达3天后,收集菌液离心取上清。取少量上清液进行SDS-PAGE电泳分析,可见一条分子量约26KD的条带。将表达蛋白进行Western-blot分析,显示表达蛋白与抑制素抗体能发生特异的抗原-抗体反应。证明所表达的蛋白为猪α抑制素成熟肽。即本研究成功地构建了重组酵母表达质粒pPICZαC-IHNα,并在毕赤酵母中对猪α-IHN实现了正确表达。
第二部分工作主要是综合应用抑制素IHN-α亚基成熟肽和follistatin两种重组融合蛋白疫苗,在夏季高温季节主动免疫种猪,以探讨主动免疫抑制素和卵泡抑素在提高猪只繁殖生产性能方面的可行性。分别用猪抑制素α亚基成熟肽和卵泡抑素重组融合蛋白疫苗主动免疫原来正常使用但在夏季发生精液品质下降的成年种公猪和断奶后长期不发情的母猪。观察成年种公猪精液品质的变化以及乏情母猪的发情情况与产仔数,检测体内相应的抗体水平和激素变化情况。
对成年种公猪主动免疫IHNα和FSP重组融合蛋白疫苗后能使其产生一定水平的抗抑制素抗体与抗卵泡抑素抗体,而对照组没有产生抗抑制素抗体与抗卵泡抑素抗体。免疫IHN组的公猪的精子活力在首免后的7天以后开始上升,并在第30天后高于对照组,但差异不显著(P>0.05);免疫IHN+FSP组的公猪的精子活力在首免后就一直上升,并在首免30天后显著高于对照组(P<0.05)。免疫IHN组的公猪精子密度在免疫之后维持不变;免疫IHN+FSP组的公猪精子密度在免疫后维持不变,但对照组精子密度持续下降,并在56、63天显著低于试验组(P<0.05);与此同时,免疫IHN组的公猪血清中睾酮水平也有上升,但与对照组相比,差异不显著(P>0.05),免疫IHN+FSP组的公猪血清中睾酮水平也上升,且与对照组相比,差异显著(P<0.05)。而在整个试验过程中,对照组的睾酮浓度变化水平不大。两组免疫组血浆中的FSH水平在首免21天以后都开始显著上升,与对照组相比差异极显著(P<0.01);两组免疫组血浆中的activin水平也在免疫后的21天有上升,与对照组相比差异显著(P<0.05)。
对母猪的免疫结果显示:分别主动免疫IHNα和FSP重组融合蛋白疫苗后能产生一定水平的抗抑制素抗体与抗卵泡抑素抗体,在整个试验阶段,对照组没有产生抗抑制素抗体与抗卵泡抑素抗体。免疫IHN组的母猪发情数目为9头全部发情,发情率为100%,远大于对照组的33.3%;免疫FSP组的9头母猪发情数目为5头,发情率为55.6%也大于对照组的33.3%。免疫IHN组平均产仔数为12.25头,高于免疫FSP组的10头和对照组C组的9.3头。