凤仙透骨草抑菌活性成分、抑菌机理及对柑橘防腐保鲜效果的研究

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柑橘是全球第一大水果,中国是世界最大的柑橘生产国,柑橘产业的发展对于中国社会经济的发展具有重要地位和作用。多年来,国内外科技工作者非常重视安全无毒、经济环保的柑橘防腐保鲜技术的研究,但至今没有理想的成果投产。本研究旨在利用植物产生的天然抗菌物质,以代替化学防腐保鲜剂,开发适合柑橘果实贮藏特性的植物源防腐保鲜剂,主要结果如下:(1)抑菌植物筛选以意大利青霉(Penicillium italicum)和指状青霉(Penicillium digitatum)为指示菌株,对96种具有消炎杀菌功效的药用植物进行抑菌活性筛选。结果发现肉桂(Cinnamom umcassia)、丁香(Eugenia caryophyllata)、凤仙透骨草(Impatiens balsamina L.)等植物丙酮提取液对两种青霉菌均具有很强的抑制作用,对P.italicum的MIC分别为3.125mg mL-1、6.25mg mL-1、12.5mg mL-1,对P. digitatum的MIC分别为3.125mg mL-1、6.25mgmL-1、25mg mL-1。综合考虑经济成本和抑菌效果,选取凤仙透骨草进行深入研究。(2)凤仙透骨草中抑菌活性成分的提取、分离和纯化采用四因素二次回归正交旋转组合试验设计,建立了凤仙透骨草中抑菌有效成分抑菌圈直径(Y)与乙醇浓度(X1)、提取温度(X2)、溶剂倍数(X3)和提取时间(X4)的回归模型:Y=35.24570+1.12726X1-0.87843X12-0.56129X22-0.85810X32-0.67513X42-1.22737X1X2。采用非线性优化的方法,得出凤仙透骨草中抑菌有效成分提取的最优工艺为乙醇浓度96.8%,溶剂倍数10倍,提取温度50℃,提取时间3h,优化条件下最大抑菌圈理论值为36.54mm。验证试验结果表明,所得模型的理论计算值与实验值吻合较好。采用生物活性追踪的方法,对凤仙透骨草中抑菌活性物质进行分离纯化,最终得到具有很强抑菌活性的单体化合物。所得化合物以IR、UV、LC-MS、1H NMR和13C NMR等波谱方法进行结构鉴定,确定为2-甲氧基-1,4-萘醌(MeONQ)。(3)凤仙透骨草提取液及MeONQ的抑菌特性及稳定性评价凤仙透骨草提取液及MeONQ均具有广谱抑菌特性,抑菌谱、抑菌稳定性高度相似,验证了MeONQ为凤仙透骨草中主要抑菌功效成分。两者对供试霉菌、酵母类真菌具有很强的抑制作用,其中对P. italicum、黑曲霉(Aspergillus niger)及啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)的抑制效果与阳性对照无显著性差异;对米曲霉(Aspergillus oryzae)及产朊假丝酵母(Candida utilis)的抑制效果显著优于阳性对照。对革兰氏阳性和阴性菌也具有一定的抑制作用,其中对志贺菌(Shigella boydii)的抑制效果显著优于阳性对照,对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)及大肠杆菌(Escherichia coli)的抑制效果则显著低于阳性对照。提取液及MeONQ单体均具有良好的热稳定性,在酸性、中性偏酸性及中性环境条件下有最好的抑制效果,紫外线照射及Fe3+浓度对提取液的抑菌活性影响较大。(4) MeONQ对P. italicum抑制机理的初步探讨1)通过生长速率法测定MeONQ对意大利青霉的毒力回归方程为Y=6.2316X+2.3121,相关系数为0.9611,EC50=2.6998μg mL-1。MeONQ能显著抑制意大利青霉的生长,并能阻止分生孢子的分化。2)通过扫描电镜和透射电镜发现,MeONQ作用后的意大利青霉菌丝形态异常,顶端细胞明显萎缩和坍塌,细胞出现严重的质壁分离,细胞内部结构紊乱,分区消失,电子密度增大,并有大量物质外渗,从而造成细胞死亡。3) MeONQ能显著抑制意大利青霉菌丝中SDH、MDH、CHT和GUN的活性。4) MeONQ能导致意大利青霉菌丝细胞膜透性的增加,电解质外泄,但细胞膜对蛋白质和核酸类大分子物质的选择性透过功能未受到MeONQ的影响。综上所述,MeONQ是通过多个作用靶点对意大利青霉的生长发育产生影响,比如作用于细胞壁、细胞膜及线粒体氧化还原酶等,从而造成菌体代谢紊乱、结构异常而解体死亡。(5)复合保鲜膜对柑橘果实的贮藏保鲜效果采用复合涂膜(10μgmL-1MeONQ、15gL-1CMC、0.5gL-1柠檬酸、5g L-1蔗糖酯、5g L-1甘油、20g L-1丙酸钙)处理赣南脐橙及南丰蜜桔果实,在相对湿度90~95%、5℃冷库中冷藏。涂膜处理能减少两种柑橘果实冷藏期间的失重,降低果实的腐烂率,保持果实较好品质,同时可以保持较高的活性氧清除能力,诱导果实产生抗病性,复合涂膜对南丰蜜桔具有更好的贮藏保鲜效果。
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