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肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)从中膜大量迁移至内膜并异常增殖是低氧肺动脉高压肺血管重建的基本病理变化。在此病理过程中,多种细胞因子、生长因子通过细胞内信号传递途径将细胞外增殖信号传至核内,在核内调节基因表达,启动细胞增殖反应。目前探讨低氧肺动脉高压(hypoxia pulmonary hypertension,HPH)中血管重建的细胞内信号传导通路的研究主要集中在STATs途径、MLCK途径和PKC途径。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt (serine/threonine kinase,Akt)参与的经磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)激活的细胞内信号通路与细胞分化、生长、凋亡和迁移等多种生物学活动密切相关。与细胞张力蛋白同源在10号染色体有缺失的磷酸酶(phosohatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)迄今为止发现的第一个具有脂质磷酸酶活性的抑癌基因。其功能是对脂质第二信使PI-3,4,5-P3进行3位脱磷酸,从而降低细胞内PIP3水平,下调Akt通路。本课题建立体外PASMCs培养模型,观察低氧培养时PASMCs Akt/PTEN信号通路中主要信号分子表达和活性的变化;并通过Ad-PTEN转染上调PTEN的表达,研究PTEN活性变化对低氧条件下PASMCs增殖和迁移的影响,以阐明Akt/PTEN信号通路调控低氧诱导PASMCs异常增殖及迁移的作用及机制,明确这一信号通路中参与肺血管重建的关键环节,从而为HPH的防治提供理论依据。研究内容:1 .原代培养PASMCs并鉴定后, RT-PCR检测常氧及低氧条件下PTEN/Akt1/Akt2/Akt3基因mRNA表达变化;免疫细胞化学和Western blot法检测上述基因蛋白定位和表达变化。2.Ad-PTEN的扩增、鉴定、转染效率、MOI、滴度测定。3.RT-PCR和Western blot检测Ad-PTEN转染后细胞PTEN基因mRNA表达及其蛋白活性变化。MTT、3H-TdR掺入实验和流式细胞仪检测常氧及低氧条件下Ad-PTEN转染前后细胞增殖变化。4.Ad-PTEN转染后常氧及低氧条件下PASMCs平面迁移距离的变化。5.RT-PCR和Western blot检测常氧及低氧条件下转染前后细胞Akt1/Akt2/Akt3 mRNA表达变化。结果:1.原代培养的大鼠PASMCs经α-SM-actin免疫细胞化学染色得到证实,并冻存第四代细胞。组织块法和酶法培养的PASMC的生长曲线和蛋白质含量上有一定程度上的差异,但差异并不显著(p>0.05),二者均于7～8 d达高峰,而后由于接触抑制而下降。组织块法培养PASMC的胞内[Ca2+]含量为(195.32±14.62) nmol/L,而酶消化法为(150.18±11.87) nmol/l,差异有显著性意义(P<0.05)。2.常氧及低氧条件下PASMCs中,RT-PCR、Western blot法在常氧条件下PASMCs中检测到PTEN/Akt1,2,3基因的表达;在低氧刺激下,PTEN的mRNA和蛋白水平均逐渐升高;低氧刺激下2h PASMCs中Akt1,2,3表达升高,6 h达高峰,12 h下降,24 h恢复到常氧水平,其mRNA和蛋白表达变化一致;免疫细胞化学结果示PTEN蛋白在PASMCs胞浆和胞核中均表达;Akt1,2,3仅在胞浆中表达。3.扩增并冻存了Ad-PTEN(CVL液)约2ml。滴度大约1.03×109 pfu/ml。经鉴定所得到的重组腺病毒确实携带着外源性目的基因PTEN片段。Ad-PTEN对PASMCs有较高的感染效率,最佳MOI为60。Ad-PTEN转染PASMCs后,PTEN在PASMCs中明显过表达。在低氧刺激下,Ad-PTEN的转染仍然能够保证PTEN在PASMCs中过表达。4.MTT检测发现低氧刺激下,PASMCs增殖明显增强并且随着低氧处理时间的延长而进一步升高,Ad-PTEN转染组PASMCs增殖明显低于未转染组。3H-TdR掺入检测发现未转染组低氧时PASMCs的3H-TdR掺入量比常氧时升高,而Ad-PTEN转染后PASMCs的3H-TdR掺入量明显低于未转染组。流式细胞仪结果显示低氧使未转染组PASMCs的G0/G1比例降低,而S+G2/M比例升高,Ad-PTEN转染使PASMCs中PTEN基因表达增强以后,低氧仅使转染组PASMCs的G0/G1比例稍有降低,但降低不显著。5.常氧培养的PASMCs随着培养时间的延长,迁移的距离逐渐增加,其中与36h比较,48h和72h的迁移距离增加有显著性意义(p<0.05)。在低氧刺激下,PASMCs迁移的距离显著行增加。Ad-PTEN转染组PASMCs迁移的距离较常氧组以及低氧处理组显著性减少。6.PASMCs Akt1,2,3 mRNA表达量在低氧2 h开始升高,6h达高峰,12 h开始降低,24 h下降至常氧水平。而Ad-PTEN转染后PASMCs Akt1 mRNA表达量升高幅度较小,各时相点间无显著差异。结论:1.正常大鼠PASMCs检测到PTEN/Akt1,2,3基因表达。低氧可刺激大鼠PASMCs S PTEN/Akt1,2,3基因表达增强。2.扩增的Ad-PTEN能够转染PASMCs并在细胞中高效的过表达PTEN。3.低氧可能通过诱导PTEN/Akt的表达和活化促进PASMCs增殖,其中Akt的表达和活化可能起主要作用。而Ad-PETN转染能够抑制低氧刺激导致的PASMCs增殖。4.低氧可能通过诱导PTEN/Akt的表达和活化促进PASMCs迁移,其中Akt的表达和活化可能起主要作用。而Ad-PETN转染能够抑制低氧刺激导致的PASMCs迁移。5. Ad-PTEN转染PASMCs致细胞内过表达PTEN能够显著性抑制Akt1,2,3基因的转录,可能是Ad-PTEN转染抑制低氧刺激导致的PASMCs增殖和迁移的分子基础。