【摘 要】
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石斛多糖由于分子量大、极性高,导致口服吸收较差,在体内不易被肠道消化和吸收,通过β-甘露聚糖酶将其水解为甘露低聚糖,能显著提高石斛多糖的生物利用度。论文以前期工作中分离得到的黑曲霉NG1306为出发菌株,采用单次单变量法探索固态发酵产β-甘露聚糖酶的最适条件,TLC法分析粗酶液水解石斛多糖的产物类型。以石斛多糖为唯一碳源诱导黑曲霉产酶,通过转录组测序技术分析差异表达基因,对筛选到的β-甘露聚糖酶基
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石斛多糖由于分子量大、极性高,导致口服吸收较差,在体内不易被肠道消化和吸收,通过β-甘露聚糖酶将其水解为甘露低聚糖,能显著提高石斛多糖的生物利用度。论文以前期工作中分离得到的黑曲霉NG1306为出发菌株,采用单次单变量法探索固态发酵产β-甘露聚糖酶的最适条件,TLC法分析粗酶液水解石斛多糖的产物类型。以石斛多糖为唯一碳源诱导黑曲霉产酶,通过转录组测序技术分析差异表达基因,对筛选到的β-甘露聚糖酶基因进行克隆和异源表达,研究重组酶酶学性质。结果表明,最适发酵培养基为珍珠岩:石斛渣=1:1（m/m）、2.0%石斛多糖、2.0%（NH4）2SO4,初始含水率为75%。在该条件下发酵得到的粗酶液蛋白浓度为2.5 mg/m L,酶活为150.75 U/m L。TLC分析表明,50°C反应2 h,石斛多糖未被完全水解,产物主要为甘露二糖、三糖、四糖和六糖等低聚糖;当反应6 h,石斛多糖被完全水解,生成大量甘露二糖,单糖和其他低聚糖的量很少。基于转录组分析,从黑曲霉中成功克隆到6个甘露聚糖酶基因ABL-00818、ABL-03475、ABL-03917、ABL-06152、ABL-09166和ABL-10129,其中ABL-03475、ABL-03917和ABL-09166在原核宿主中成功表达,但是只有ABL-03475具有活性。酶学性质分析表明,ABL-03475的最适温度为35°C,最适p H为8.0,最高酶活力为68 U/m L。TLC分析表明,ABL-03475能够将石斛多糖水解为甘露六糖、四糖、三糖、二糖以及少量单糖。本研究通过优化固态发酵的培养基条件,获得黑曲霉固态发酵生产β-甘露聚糖酶的最适条件。基于转录组分析,成功克隆了黑曲霉中的β-甘露聚糖酶基因,通过异源表达探究其酶学性质,TLC分析主要水解产物类型,这将为后续试验中高效制备石斛寡糖奠定基础。
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