核心岩藻糖基化是一种对糖蛋白重要的翻译后修饰和功能的调控,由α-1,6岩藻糖基转移酶(Fut8)进行催化。研究发现糖链不但参与维系正常细胞间的信息传递,而且在肿瘤细胞的恶性转化、血管浸润、转移中发挥重要作用。我们的前期研究发现E—钙粘蛋白(E-cadhefin)是核心岩藻糖基转移酶的底物,E-cadherin核心岩藻糖基化修饰可引起肿瘤细胞内β—连环蛋白(B-catenin)亚细胞分布的改变。β-catenin作为E-cadherin的下游分子,在平衡细胞粘附和Wnt信号通路中的有重要作用。β-catenin在细胞内的丰度较高,除了较少一部分和E-cadhedn结合组成E-cadherin/α、β-catenin复合物参与细胞骨架外,还有一部分游离于胞浆池中,参与Wnt通路的信号转导。最近发现糖蛋白半乳凝集素-3(galectin-3)是β-catenin新的结合蛋白,与β-catenin相似的是galectin-3也能够进入细胞核,也能结合转录因子TCF-4,共同激活下游基因的转录,已有大量文献报道galectin-3参与肿瘤细胞的恶性转化和凋亡的调节。但是对于galectin-3是否也是核心岩藻糖基转移酶的底物尚没有人报道,galectin-3糖链的改变,是否会影响半乳凝集素-3分子对β-catenin的结合能力?是否也会引起β-catenin的亚细胞分布的改变?引起了我们的兴趣。以本实验室的前期实验为基础,本论文采用的研究对象是人巨细胞性肺癌细胞株95C和95D,这对细胞来源于同一病人,具有相同的遗传背景,但是转移潜能不同。为此我们建立了两对细胞模型:在低表达Fut8的95C细胞株中通过质粒转染的方法进行Fut8过表达;将Fut8表达水平较高的95D细胞株转染表达Fut8的Si-RNA质粒。接下来我们主要进行了两部分实验,在第一部分中我们的实验验证:Ⅰ) E-cadherin是核心岩藻糖基转移酶的底物,β-catenin无核心岩藻糖糖链结构的形成。Ⅱ)我们通过免疫共沉淀方法证明在过表达Fut8的95C细胞株中,β-catenin总体酪氨酸磷酸化(PY20)以及654位点的酪氨酸磷酸化水平均呈现低水平,而在95D转染Si-Fut8质粒的细胞株中,β-catenin酪氨酸磷酸化的水平及654位点的酪氨酸磷酸化水平均较高。Ⅲ)在Fut8过表达的95C细胞中,核内的β-catenin的表达水平降低;而在Si-Fut8表达的95D细胞中,核内的β-catenin表达水平高于相应的对照组;而在两组细胞模型中β-catenin的总量没有明显变化。有文献报道β-catenin酪氨酸磷酸化水平越高,其与E—钙粘蛋白的结合力越弱,因此我们推测E-cadherin糖基化修饰影响了β—连环蛋白酪氨酸磷酸化水平,这在一定程度上能够解释其核内表达水平的变化。我们第一部分主要研究了细胞膜β-catenin受到E-cadherin糖基化修饰的影响而入核,我们考虑可能还有另一种可能:在核心岩藻糖基转移酶的作用下,还有其它未知底物共同调节β-catenin的亚细胞分布。考虑到新近发现的β-catenin的结合蛋白——galectin-3也是糖蛋白,不但能与β-catenin一道进入细胞核结合转录因子TCF-4,而且能与α-catenin竞争结合β-catenin,这些文献报道提示galectin-3在调节β-catenin亚细胞分布中有重要作用。我们的第二部分实验发现:Ⅰ) Fut-8过表达能够轻微上调galectin-3蛋白质表达水平,Fut-8下调能够显著降低galectin-3蛋白质水平,但在转录水平上galectin-3的mRNA表达水平没有发生改变。Ⅱ) galectin-3是Fut-8的底物,具有核心岩藻糖残基。Ⅲ) Fut-8过表达的95C细胞中,galectin-3和β-catenin的结合能力明显上调,而在si-Fut8的95D细胞中,galectin-3和β-catenin的结合能力显著下调。galectin-3可能是核心岩藻糖基修饰的蛋白质分子,其糖链的变化就会影响该分子与β-catenin的结合能力。我们发现Fut-8能够影响galectin-3蛋白质的水平,但不能在转录水平上调节galectin-3 mRNA的表达,这引起了我们强烈的兴趣,Selvi Ramasamy等曾在Molecular Cell撰文报道MUCl的第36位的N糖链能通过MicroRNA322来调控galectin-3的表达水平。据此我们推测Fut-8可能通过调控其底物蛋白糖链发生改变,也能通过未知途径影响MicroRNA322的表达,MicroRNA322能够结合galectin-3的mRNA 3’UTR,抑制翻译而不影响mRNA的稳定性,调节galectin-3蛋白质表达水平,对于这部分内容尚需要深入探索。综上所述,E-cadherin的核心岩藻糖基化修饰影响了β-catenin酪氨酸磷酸化水平,从而影响了β-catenin的亚细胞分布;而galectin-3也是核心岩藻糖基修饰的蛋白质分子之一,其糖链的改变能够影响其与β-catenin结合能力,间接影响了胞浆池β-catenin的亚细胞分布。这种多元的调控方式揭示了核心岩藻糖基化修饰的蛋白质分子之间复杂的博弈关系,我们的实验对核心岩藻糖基化修饰在肿瘤的恶性转化过程的复杂作用做了积极的探索。