布拉氏酵母菌是一种从印尼荔枝等水果中分离到的非致病性益生酵母菌，具有抗菌、抗毒、止泻、维持宿主胃肠道微生态平衡、提高机体非特异性免疫力等益生性。目前，布拉氏酵母菌的研究主要集中在临床应用方面，而针对其作用机制，特别是在分子水平上的作用机制，以及遗传改造等却少有研究和报导。自Smith提出表面展示技术以来，表面展示技术得到了快速发展。对于真核生物蛋白来说，酵母表面展示系统无疑是比较理想的表面展示系统。利用益生菌表面展示系统研究活载体疫苗是医学以及兽医学领域中重要的应用之一，人们已经利用酿酒酵母和乳酸杆菌作为平台研究活载体疫苗，而布拉氏酵母菌作为最有价值的益生菌之一，其表面展示系统在国内外尚未有报导。本研究利用a-凝集素成功地构建了两种布拉氏酵母菌表面展示系统：瞬时表达表面展示系统和稳定表达表面展示系统。这是第一次将表面展示技术用于布拉氏酵母菌中，拓宽了布拉氏酵母菌的应用领域。本研究主要做了以下三方面的工作：（一）瞬时表达表面展示系统：1.瞬时表达表面展示质粒的构建：将AGA1基因（SbAGA1）以及AGA2表达盒克隆到基础质粒pSP-G1上，使SbAGA1在持续表达启动子pTEF1的控制之下，AGA2表达盒在持续表达启动子pPGK1的控制之下，构建了瞬时表达表面展示质粒pSDSb；将SbAGA1基因和AGA2表达盒克隆到基础质粒pSP-G2上，使SbAGA1在持续表达启动子pPGK1的控制之下，AGA2表达盒在持续表达启动子pTEF1的控制之下，构建了瞬时表达表面展示质粒pSDSb2。2.利用EGFP蛋白作为报告蛋白，鉴定瞬时表达表面展示系统的可用性：将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因克隆到pSDSb、pSDSb2质粒上的AGA2基因表达盒内，构建EGFP表面展示质粒。荧光分析和Western blot结果表明，EGFP蛋白能够展示在布拉氏酵母菌细胞表面。3.不同来源的Aga1p对EGFP蛋白展示效率的比较：分析SbAGA1基因和ScAGA1基因的同源性以及SbAGA2基因和ScAGA2的同源性，利用荧光分析和流式细胞术比较pSDSb和pSDSc两种表面展示质粒对外源蛋白的展示效率。荧光分析结果和流式结果表明，pSDSb和pSDSc两种表面展示质粒对外源蛋白的展示效率差异不显著（P=0.974）。（二）稳定表达表面展示系统：1.稳定表达表面展示质粒的构建：破坏瞬时表达表面展示质粒上的2-micron origin元件，构建稳定表达表面展示质粒pLSDSb和pLSDSb2。2.利用EGFP蛋白作为报告蛋白，鉴定稳定表达表面展示系统的可用性：将EGFP基因克隆到pLSDSb、pLSDSb2质粒上的AGA2基因表达盒内，构建EGFP表面展示质粒。荧光分析和Western blot结果表明，EGFP蛋白能够展示在布拉氏酵母菌细胞表面。（三）布拉氏酵母菌表面展示系统的应用研究1.瞬时表达与稳定表达表面展示系统对EGFP蛋白展示效率的比较：利用荧光、流式分析比较两种表面展示系统对EGFP的展示效率，荧光结果表明：在培养24h时，瞬时表达表面展示系统可将EGFP展示在酵母细胞表面，培养120h后，荧光逐渐消失；与瞬时表达表面展示系统不同，在培养36h时，稳定表达表面展示系统可将EGFP展示在酵母细胞表面，只要培养酵母细胞，外源蛋白可一直表达。流式结果表明：pSDSb-GFP的展示效率为87.89%，pLSDSb-GFP的展示效率为92.34%，pLSDSb2-GFP的展示效率为92.45%，说明稳定表达表面展示系统的展示效率稍高于瞬时表达表面展示系统。2.将鸡柔嫩艾美耳球虫微线蛋白-2（EtMic2）基因克隆到pSDSb、pSDSb2质粒上，构建EtMic2瞬时表达表面展示质粒；通过间接免疫荧光分析可知，在培养12h时，EtMic2即可展示在酵母细胞表面。