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氧化反应是动物机体内物质新陈代谢不可缺少的生理活动,其实质是物质间的电子传递。然而部分电子在传递过程中不可避免的会发生逸散,这些逃逸的不配对电子就是所谓的自由基。当环境中的自由基过量累积,超过了抗氧化系统的还原力,就会产生氧化损伤,使动物体处于氧化应激状态。芽孢杆菌是一种优质、安全的肠道益生菌,具有安全、无耐药性等特点。其某些菌株是一种理想的微生物抗氧化剂。本研究以本实验筛选获得的一株抗氧化活性较好的芽孢杆菌B10为材料,分别研究了其对巨噬细胞(RAW264.7)和小鼠在氧化应激状态下的抗氧化功能的影响,其主要研究结果如下:
1.在鼠巨噬细胞(RAW264)培养液中分别添加0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、500μmol/L的H2O2,研究其对培养3h、6h、9h后巨噬细胞抗氧化功能的影响。结果表明,与对照组相比,当细胞培养液中H2O2低于200μmol/L时,不会引起巨噬细胞产生明显的应激损伤;300μmol/L时细胞LDH、MDA活性明显降低(P<0.05),但是T-AOC并未发生明显变化;400μmol/L时,巨噬细胞T-AOC有所降低但是并不显著;当增加至500μmol/L时,T-AOC有所降低,MDA含量和LDH活性均明显降低,说明此时细胞已产生氧化损伤。比较各时段巨噬细胞抗氧化活性发现,培养6小时后可以产生适当的氧化应激。由于H2O2的作用时间和作用浓度存在互作效应。因此确定500μmol/L的H2O2处理6h可使巨噬细胞产生适当的应激条件。
2.以维生素E(VE)为抗氧化剂阳性对照,研究了枯草芽孢杆菌B10对氧化应激状态下巨噬细胞(RAW264)抗氧化的影响。结果发现:与氧化应激组相比,培养液中添加VE可以提高巨噬细胞培养液的T-AOC,但是不能提高相关抗氧化酶类的活性,也不能缓解由脂质过氧化反应引起的丙二醛(MDA)含量升高。VE主要是依靠本身的还原性中和环境中的氧化物质,从而实现其抗氧化功能。与氧化应激组相比,培养液中添加枯草芽孢杆菌B10能够显著提高巨噬细胞的T-AOC(P<0.05),降低了MDA的含量(P<0.05)。B10主要通过诱导巨噬细胞提高GSH-Px(P<0.05)、SOD(P<0.05)和CAT(P<0.05)等抗氧化酶的活性,提高巨噬细胞对超氧阴离子等自由基的清除能力,降低MPO等活性从而减少内源性自由基的产生(P<0.05)。与VE组相比,B10可以通过诱导细胞提高对抗氧化酶以及抗氧物质的合成,提高细胞的抗氧化活性,其抗氧化效果更好。
3.研究了枯草芽孢杆菌B10对氧化应激状态下巨噬细胞免疫功能的影响。分别用适当浓度的枯草芽孢杆菌B10和VE孵育巨噬细胞12小时,然后弃去培养液中的B10和VE,再添加500μmol/L的H2O2刺激6h。结果发现,与空白组相比,H2O2可以影响巨噬细胞部分细胞因子的分泌水平,可以显著提高IFN-α、IL-12、IL-8等的的含量。与氧化应激组相比,维生素E可以使IFN-α的含量降低;枯草芽孢杆菌B10则能够使IFN-γ的含量降低。与VE组相比,培养液中添加枯草芽孢杆菌B10能够使IFN-α、IP-16的含量显著增加(P<0.05),IFN-γ、IL-1β的含量显著降低。H2O2是强氧化剂,刺激细胞产生明显的炎症,枯草芽孢杆菌可以通过提高细胞的抗氧化活性,降低氧化损伤,从而减轻炎症反应,B10的抗炎效果与其抗氧化效果一致。
4.研究了枯草芽孢杆菌B10对应激状态巨噬细胞以及高脂日粮小鼠氧化应激相关基因表达的影响。将60只体重相近(35g±1g)的普通ICR小鼠随机分为对照组(基础日粮)、高脂组(高脂日粮)、TBHQ组(添加0.01%(W/W)TBHQ的高脂日粮)处理组(添加0.1%芽孢杆菌B10的高脂日粮)。每组3个重复,每个重复5只。巨噬细胞分组及处理同3。结果表明,与对照组相比,B10能够明显缓解高脂引起的小鼠肥胖(P<0.05),降低肝脏中8-羟基脱氧鸟苷水平(P<0.05),以及降低GR、XO和AP-1的表达水平(P<0.05),p38和p53基因表达水平显著提高(P<0.05)。在巨噬细胞中,与对照组相比,B10可以显著降低SOD(P<0.05)和p53表达水平(P<0.05),可以显著升高GST(P<0.05)和AP-1(P<0.05)。芽孢杆菌B10可以诱导小鼠和巨噬细胞增强机体的抗氧化能力,但是B10对小鼠肝脏和巨噬细胞诱导途径不同。