纳米医学是纳米技术在疾病预防和治疗等领域的重要应用,它的快速发展为不断增进人类的健康福祉发挥着越来越重要的推动作用。其中,基于高分子纳米材料的基因和药物递送载体为某些棘手疾病(如癌症、椎间盘退化等)的治疗带来了新策略。然而,面对基因或药物递送过程中,体内外复杂的各种生理障碍,进一步发展更加安全高效的递送载体仍然面临着诸多挑战。从纳米粒子制备到进入靶向细胞内发挥治疗作用,需要克服多重障碍,如材料稳定性、体内循环、靶组织富集与渗透、细胞摄取、内涵体逃逸以及有效释放等。为了更加高效地克服这些生理屏障,提高递送的效率,需要不断发展和优化新的纳米载体体系,这也促进了科学家们在这个领域的不断探索。本论文主要通过多组分反应,简便高效地构建具有多功能性官能团的高分子载体,以便更加高效地克服药物或基因递送过程中的多重生理障碍。首先,通过Passerini反应制备同时含有疏水基团和pH响应性咪唑基团的高效内涵体逃逸分子,一方面利用该分子与聚阳离子基因载体结合,提高载体的内涵体逃逸能力,进而增强了最终的基因转染效率;另一方面在负载小分子前药的两亲性嵌段聚合物载体中引入该内涵体逃逸分子,增加了其内涵体逃逸的效率,在上调肿瘤细胞内氧化水平的同时,更大程度上地激活氧化响应性小分子前药,最终达到协同增强抗肿瘤效果。其次,利用基于硫内酯化学与迈克尔加成反应的多组分反应构建了多种含多功能性官能团的阳离子聚合物,显著提高了质粒DNA的递送能力。最后,针对慢性的椎间盘退行性疾病,发展了病变组织微环境响应性的长效缓释且高效的miRNA递送体系,实现了对椎间盘退行性疾病高效的局部基因治疗。具体来说,本论文的研究内容和主要结论包括以下四个部分:一、利用Passerini三组分反应制备了同时含有疏水烷基和咪唑基团的甲基丙烯酸酯单体(ImOAMA),以聚甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酷(PDMAEMA)作为大分子链转移剂,通过可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)方法聚合得到了结构规整的两嵌段聚合物。整合的疏水烷基和咪唑基团分别具有与内涵体膜相互融合和实现质子海绵效应的功能,从而协同促进内涵体逃逸过程。因而,在常规的聚甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(PDMAEMA)基因载体中引入具有适当聚合度(DP)的内涵体逃逸链段,大大提高了PDMAEMA的内涵体逃逸能力。实验证明,该嵌段共聚物在仿内涵体酸性(pH=6.5或5.7)条件下呈现出较高的溶血活性,侧面证实具备内涵体逃逸性能。同时,以该嵌段共聚物负载质粒DNA的基因转染效率与均聚物PDMAEMA相比,有着高达8.9倍的提升。二、设计合成了一种由缩醛键连接的含肉桂醛的甲基丙烯酸酯单体(MMSD)。以聚乙二醇(PEG)为大分子链转移剂,通过RAFT方法共聚MMSD单体和内涵体逃逸单体(ImOAMA),得到一种具有pH响应的两亲性嵌段共聚物(PEG-b-P(MMSD-co-ImOAMA))。将该两亲性嵌段聚合物,用于负载可被活性氧(ROS)响应激活的苯硼酸酯修饰的喜树碱前药(ProCPT),经自组装得到尺寸为～60 nm的胶束粒子。实验证明,该纳米粒子不仅可以在肿瘤组织或细胞内环境下,通过酸响应释放肉桂醛分子,进而提高细胞内的ROS含量;同时,显著提高的ROS可以更大程度上激活前药分子ProCPT形成具有生物毒性的原药分子喜树碱(CPT),从而发挥药效促使细胞凋亡。动物实验表明,这种纳米粒子不仅可以在肿瘤部位实现较好的富集与滞留,而且可以显著地抑制肿瘤体积的增长。病理学分析显示出该体系对动物正常器官没有造成明显损伤,具有较好的生物安全性。综上所述,这种通过提高细胞内ROS含量与特异性激活前药的双重机制,可以发挥对肿瘤的氧化治疗与化疗协同治疗效果。三、基于硫内酯化学和迈克尔加成的多组分反应,合成得到多种含不同疏水官能团与不同胺基的多官能团的聚阳离子化合物,并从中筛选出具有最佳官能团组合的高效聚合物基因载体。利用含有不同数目乙烯亚胺单元的胺类化合物与不同疏水基团修饰的硫内酯进行开环反应,反应产生的巯基与随后加入的聚丙烯酰氧乙基甲基丙烯酸酯(PAOEMA)进一步发生迈克尔加成反应,最终得到一系列含不同氨基和疏水性基团的阳离子聚合物。随后,通过细胞摄取和细胞内分布等实验证明,经四乙烯五胺和全氟丙基修饰的阳离子聚合物(P3D)能够有效提高复合物的进细胞能力并且能明显增强其内涵体逃逸能力,从而表现出较其它聚合物和通用转染试剂bPEI(支化聚乙烯亚胺,Mw=25 kDa)更优异的基因转染效率。综合以上结果,我们成功运用硫内酯化学与迈克尔加成的多组分反应,简单高效地将不同功能性的基团整合到同一个聚合物分子中,得到一系列具有高效克服基因递送过程中不同生理屏障的基因载体,并通过细胞实验筛选出了最佳的高效低毒结构组合。四、椎间盘退变作为一种慢性退行性疾病,依靠microRNA(miRNA)等基因治疗方式靶向干预,往往需要持久进行才能产生理想的治疗效果。考虑到在纤维化的椎间盘组织中,基质金属蛋白酶(MMPs)的高表达大大促进椎间盘退变的发生和发展,设计构建了一种可注射型的MMPs双重响应的水凝胶体系,利用这种水凝胶体系实现稳定、持久且智能地递送治疗型基因miR-29a,并用于抑制椎间盘退化。首先,制备了可针对MMPs响应的阳离子嵌段共聚物,聚乙二醇-嵌段-聚(N’-(N-(2-氨乙基))-2-氨乙基天冬氨酸)-胆固醇(PEG-PAsp(DET)-Chole)(PGPC),并利用其与miR-29a进行络合。其中,PAsp(DET)组分有很好的溶酶体逃逸能力与可降解特性使其有具备良好的基因递送效率的同时表现出低毒性,而多肽GPLGVRG则可以被MMP酶特异性切断。同时,终端引入的胆固醇部分,可以通过疏水作用,提高由阳离子嵌段聚合物与miRNA形成的聚离子复合物胶束(miR-29a/PGPC)的稳定性。进一步地,为了实现持续释放的目的,将络合有miR-29a的复合胶束均匀包埋进能被MMPs响应性降解的水凝胶中。该水凝胶是由马来酰亚胺封端的八臂PEG和CGPLGVRGC肽段溶液混合形成的。通过原位注射凝胶化,miR-29a可以被限定在腰椎间盘退变(IDD)区域而不会溢出到体循环中,再通过MMPs的双重响应机制,将miR-29a以可控持续的方式递送到髓核细胞中。在动物实验操作中,首先将miR-29a/PGPC复合物胶束和CGPLGVRGC混合溶液与八臂马来酰亚胺封端的星形PEG溶液,再混合注入到椎间盘部位以原位形成包裹有miR-29a复合物胶束的水凝胶。当处于MMPs高表达的IDD部位后,MMPs会慢慢降解水凝胶释放复合物胶束,同时MMPs会进一步切断复合物胶束的PEG壳层,从而更加有效地进入到髓核细胞中,以及实现高效的内涵体逃逸,完成miR-29a的递送过程。miR-29a通过沉默MMP-2的表达,并阻断β-catenin由细胞质进入细胞核的传输途径,从而成功抑制椎间盘纤维化。这种通过包裹复合物胶束的双重响应水凝胶体系能实现对慢性IDD区域的miR-29a针对性缓释,同时也为慢性疾病的局部基因治疗提供了一种新的策略。