PCNA反义探针用于基因显像的实验研究

来源 :华中科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:huangxl2000
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目的:以放射性核素标记针对增殖细胞核抗原(PCNA)mRNA的反义寡核苷酸,通过一系列体外和体内实验研究,探讨该标记物作为一种分子探针应用于反义显像研究的价值。 方法:分别合成一段针对PCNAmRNA5端非编码区的反义和正义寡核苷酸,在双功能螯合剂S-Acetyl-NHS-MAG3的螯合作用下,以99mTc进行标记。标记后观察标记率,放射化学纯度,标记物与互补寡核苷酸的结合能力,标记物在PBS和血清中的稳定性;观察该标记物在增殖旺盛的卵巢癌细胞中与靶基因特异性结合的能力和摄取动力学,研究标记物在正常昆明小鼠体内的生物学分布,并对荷卵巢癌裸鼠进行显像;研究标记物在增殖旺盛的血管平滑肌细胞中与目的基因特异性结合的能力和摄取动力学。 1.寡核苷酸的偶联和标记 人工合成一段针对PCNAmRNA5端非编码区的含18个碱基的反义寡核苷酸,相应的正义链合成后用于对照实验。在相同条件下分别对正义和反义寡核苷酸进行偶联和标记。在一定条件下,寡核苷酸与NHS-MAG3发生偶联反应,以0.7×28cmSephadexG25凝胶柱分离偶联和游离的核酸。随后以99mTc对偶联物进行标记,以0.7×28cmSephadexG25凝胶层析柱对标记产物进行标记率的分析,以反相Sep-PakC18小柱进行放射性化学纯度分析。作为对照,以未偶联MAG3的核酸按相同条件进行标记。将标记物与PBS和新鲜人血清在37℃条件下孵育,上样至Sep-PakC18小柱,观察放射性峰的漂移情况和放射化学纯度。分别将标记的正义和反义核酸与互补链在37℃条件下共同孵育1小时,再以Sep-PakC18小柱观察洗脱液放射性峰值漂移情况,以判断标记物与互补链的分子杂交能力。 2.标记物对卵巢癌细胞增殖以及对目的基因表达的影响 以MTT试验初步筛查反义探针对卵巢癌HO8910细胞的有效作用浓度;以5μM浓度的反义探针作用于HO8910细胞后,以流式细胞仪观察细胞增殖情况;另外以RT-PCR和Western-blotting观察一定浓度的反义、正义探针对卵巢癌HO8910细胞PCNAmRNA和蛋白表达的影响。 3.标记物在卵巢癌细胞株HO8910细胞中的摄取和清除 取卵巢癌HO8910细胞,加入标记的反义、正义寡核苷酸后分别在37℃和22℃条件下培养,于不同时间进行细胞计数,检测细胞和上清液中的放射性计数,计算细胞的摄取百分率。正义和反义探针与不同温度下培养的细胞孵育达到最大摄取后更换为不含探针的培养液,分别在37℃和22℃条件下培养,于不同时间进行细胞计数,检测细胞和上清液中的放射性计数,计算细胞内放射性滞留率。 4.标记物在正常昆明小鼠体内的生物学分布以及对肿瘤模型的显像研究 取正常雌性昆明小鼠70只,分为两组,分别经尾静脉注射正义和反义探针,925kBq/只,在不同的时间点眼眶取血后将动物引颈处死。取血、心、肝、脾、肺、肾、小肠、肌肉、骨骼、卵巢、脑组织,生理盐水冲洗后以滤纸擦干称重,γ-计数器测各样品和标准源放射性计数(cpm),计算各脏器每克组织放射性占总注入放射性的百分比。 取荷卵巢癌雌性裸鼠8只,随机分为A、B、C三组。A组(n=3)和B组(n=3)分别经尾静脉注入18.5MBq(约10μgDNA)99mTc-MAG3-ASON和99mTc-MAG3-SON;C组(n=2)每只尾静脉注入非标记的ASON10μg,2h后再注入99mTc-MAG3-ASON18.5MBq。每只动物以800~1000mg/kg体重腹腔注射20%的乌拉坦(溶解于生理盐水)麻醉。注入显像剂后15min,30min,1h,2h,5h,10h及18h,SPECT仪后位采集图像。以低能高分辨率准直器采集,距阵256×256,能峰设置140keV窗宽20%,放大倍数为4.0,每帧采集200s。 5.标记物对增殖的血管平滑肌细胞增殖以及对目的基因表达的影响 以MTT试验初步筛查反义探针对增殖旺盛的血管平滑肌细胞的有效作用浓度;以5μM浓度的反义探针作用于增殖细胞后,以流式细胞仪观察细胞增殖情况;另外以RT-PCR观察一定浓度的反义、正义探针对血管平滑肌细胞PCNAmRNA表达的影响。 6.标记物在增殖的血管平滑肌细胞中的摄取和清除 将正义、反义探针以30ng/ml的浓度分别溶解于含10%和1%胎牛血清的DMEM中,分别加入对数生长期及平台期大鼠主动脉平滑肌细胞,在37℃条件下孵育,检测不同时段的摄取百分数。根据摄取实验结果,分别以含反义和正义PCNA寡核苷酸探针的培养液培养对数生长期和平台期细胞,待探针达到最大摄取后更换为不含探针的培养液,洗涤数次后继续培养,分别检测不同时间点两种探针在细胞中的滞留率。 MTT和流式细胞仪检测实验表明,5μM浓度的99mTc-MAG3-ASON能显著抑制HO8910细胞增殖,以此浓度的99mTc-MAG3-ASON和99mTc-MAG3-SON分别作用于增殖的HO8910细胞,发现前者能显著减低细胞PCNAmRNA和蛋白的表达。 37℃条件下,卵巢癌细胞HO8910对99mTc-MAG3-ASON和99mTc-MAG3-SON的摄取均于60min时达到高峰,前者峰值明显高于后者,分别为25.51%±3.56%和12.34%±2.45%,(P<0.01,n=4)。22℃条件下,细胞对ASON和SON的摄取峰时为120min,峰值无明显差异。37℃和22℃条件下,240min时99mTc-MAG3-ASON在HO8910细胞内的滞留高于99mTc-MAG3-SON。22℃条件下,两种探针在HO8910细胞中的清除速度均明显低于37℃。 99mTc-MAG3-ASON和99mTc-MAG3-SON在正常昆明小鼠体内的时间生物学分布情况一致。放射性物质主要经肾脏和肠道排泄,早期放射性药物主要分布于血液、肝脏和肾脏,随着时间延长,肝脏、肾脏和血液中的放射性逐渐下降,肠道中的放射性分布逐渐浓聚,3h以后肠道放射性分布呈缓慢减低趋势。但12h时,肠道放射性分布相对于6h上升,此时放射性主要分布于肝脏、肠道和血液。在整个过程中,卵巢、肌肉、骨骼、脑组织、肺和脾脏的放射性分布较低,随时间推移缓慢减低。 注射99mTc-MAG3-ASON后30min,肿瘤部位开始出现放射性浓集,60min时肿瘤部位放射性浓聚最明显,此时肝脏、膀胱及肠道亦可见放射性浓集,上腹部本底偏高,对侧肢体相应部位以及上肢和头胸部显像剂分布稀疏,T/NT=3.01±0.35(n=3)。随后肿瘤组织放射性分布呈减低趋势,但清除缓慢。至注射反义探针后10h,腹部放射性分布明显减低,头颈部及未接种肿瘤的肢体部位放射性分布明显减低,肿瘤部位显影逐渐清晰,此时显像剂主要分布于肠道和肿瘤部位,此时的T/NT=4.10±0.28(n=3)。在所有时间点,注射99mTc-MAG3-SON组和阻断组肿瘤裸鼠肿瘤部位的放射性浓聚均较反义组低。 MTT和流式细胞仪检测实验表明,5μM浓度的99mTc-MAG3-ASON可以显著抑制细胞增殖。与99mTc-MAG3-SON相比,99mTc-MAG3-ASON可以显著减低增殖的血管平滑肌细胞PCNAmRNA的表达。 99mTc-MAG3-ASON在对数生长期平滑肌细胞中的摄取显著高于99mTc-MAG3-SON,但在平台期细胞中两者的摄取无显著差异,99mTc-MAG3-ASON在对数期细胞中的摄取高于平台期细胞。240min时,99mTc-MAG3-ASON在对数生长期细胞中的滞留(79.6%±0.96%)高于99mTc-MAG3-SON(59.8%±0.75%),P<0.05,n=4。平台期两种探针的清除无显著差异。 结论:在双功能螯合剂S-Acetyl-NHS-MAG3的作用下,99mTc能对含18个碱基的PCNA寡核苷酸成功地进行标记;经化学修饰、核素标记后的反义PCNA探针不仅在体外保持稳定,而且在细胞中仍能与整个目的基因上的靶序列以碱基互补配对的方式特异性结合;在体外摄取实验中,反义PCNA探针能选择性聚集于靶细胞内;在对动物模型的体内显像研究中,该探针能聚集于靶组织,清晰显示肿瘤,因此该探针可以作为一种新的分子显像剂进一步用于疾病的基因显像的研究。
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