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支原体种类繁多,能够感染禽类的支原体至少有28种。大多数支原体属于条件性致病菌,仅有少数支原体可导致禽类发病。支原体单独或混合感染不仅可导致家禽产生慢性呼吸道病、关节炎和气囊炎等,而且还可导致禽类生长发育不良、生产性能降低等,产生十分严重的经济损失。本研究从发生呼吸困难的孔雀和发生瘫痪的商品肉鸡分别分离出两种不同的支原体,进行了病原学鉴定、诊断方法建立和全基因组测序研究。现汇报如下:1.支原体的分离鉴定、生物学特性和16S rRNA基因系统发育分析(1)孔雀源支原体按照常规方法对发病孔雀进行支原体的分离和纯化、形态学鉴定和生理生化实验,进行了16S rRNA基因测序,结果分离出一株家禽支原体(Mycoplasma gallinaceum,MGC),与家禽中常见的鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)同属于支原体科、支原体属,但为不同的种,命名为Peacock20181011。该菌生长速度较快,经过2~3次纯培养后,液体培养12~20 h即可观察到培养基颜色由红变橙黄,而MG和MS等其它支原体一般在48~72 h才发生颜色的改变。结合16S rRNA基因测序分析显示,该菌与MGC经典模式菌株NCTC10183(LR214950)的相似性为99.8%,而与家禽经典菌株MG、MS的相似性仅为73.9%和88%。综合比较显示,该菌株是一株MGC新菌株。致病性研究表明,该菌株不会引起SPF鸡病变,不会致死鸡胚,但可引起鸡胚发育迟缓以及爪部蜷缩等病变,具有一定的鸡胚致病性。最小抑菌浓度实验(minimum inhibitory concentration experiment,MIC)结果显示该菌对单硫酸卡那霉素和氟苯尼考等6种药物敏感,为临床该病的治疗用药提供了依据。(2)肉鸡源支原体利用常规的支原体分离鉴定方法从发生瘫痪的肉鸡关节液中分离出一株支原体,该菌株与MS模式菌株WVU1853高度同源,16S rRNA基因相似性为98.5%,而与MGC、MG、鸡支原体和火鸡支原体的相似性分别为92.8%、77.4%、89.5%和90.1%。结合理化特征和16S rRNA基因序列同源性,确定新分离菌株属于MS,命名为WF2018。鸡胚接种试验表明,MS可以致死SPF鸡胚,引起鸡胚发育迟缓,致病性明显强于MGC。MIC结果则与MGC相同。2.建立了检测MGC的PCR方法和针对MS的LAMP方法(1)PCR诊断利用Primer 5软件,针对MGC 16S rRNA基因序列具有种属特异性的高保守区段,设计1对PCR引物,进行了PCR反应温度优化、特异性和灵敏度评估。结果表明,其反应最佳退火温度为52℃,最小检测剂量为1.07 pg/μL,且与MG、MS和莱氏无胆甾原体(A.laidlawii)等无交叉反应,具有较好的特异性和灵敏度,适合于临床MGC的快速诊断。(2)LAMP通过Primer Explorer V5软件,针对MS VLHA基因具有种属特异性的高保守区段设计LAMP引物,并进行反应条件优化。结果表明,LAMP反应的最佳温度为63℃,扩增时间为60 min,最低检测的剂量为807 fg/μL,且与MG、MGC和A.laidlawii等反应阴性,为MS的特异性诊断提供了方法。3.分离株的基因组序列测定和功能分析利用二代和三代测序技术,分别对Peacock20181011和WF2018进行了全基因组测序,并进行基因组成分和功能分析。(1)Peacock20181011菌株该菌株基因组全长为1 183 913 bp;预测有898个基因;含有非编码RNA(non coding RNA,ncRNA)46个,其中5S rRNA 3个拷贝,16S rRNA和23S rRNA各4个拷贝;(G+C)mol%含量为28.7%。该菌与MGC菌株模式菌株NCTC10183和南非流行株B2096 8B在基因组方面存在一定的差异。对Peacock20181011基因组进行了COG和GO数据库注释,发现其功能基因较多;同时,进行了KEGG数据库比对,预测了其代谢通路,发现该菌株具有较为完整的糖酵解/糖异生代谢途径。数据库比对显示,含有20个毒力基因和2个四环素耐药基因。(2)WF2018菌株该菌株基因组全长为809 346 bp;预测有743个基因;含有48个ncRNA,其中含有3个拷贝5S rRNA,16S rRNA和23S rRNA各有2个拷贝;(G+C)mol%含量为28.36%。该菌与MS模式菌株NCTC10124和我国地方流行株HN01等基因组信息相似。同MGC基因组分析方法相同,对该菌株进行了COG、GO和KEGG等数据库比对分析,发现该菌株与经典菌株GX11-T的蛋白功能分类和部分代谢通路存在一定的差异。数据库比对显示,共有67个毒力基因,其中54个为VLHA,还预测到该菌株有8个抗生素抗性基因,319和631号基因与氟喹诺酮抗生素抗性相关,707号基因与利福霉素的耐药性相关。