Hsa_circ_0045462在慢性阻塞性肺疾病肺动脉重塑中的作用及机制的初步研究

来源 :苏州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dragon121212
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
肺动脉重塑是肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)的主要病理基础,在肺动脉重塑过程中,肺动脉平滑肌细胞(pulmonaryarterial smoothmuscle cells,PASMCs)的过度增殖及凋亡抑制是肺动脉重塑的特征性病理改变。非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)是一类不具备蛋白编码功能的RNA,包括微小 RNA(microRNA,miRNA)、长链非编码 RNA(long non coding RNA,lncRNA)、环状 RNA(circular RNA,circRNA)等。circRNA 是一种特殊类型的 ncRNA,是 RNA领域中一个最新的研究热点,circRNA与含5’和3’末端的线型ncRNA不同,circRNA的5’头端与3’尾端相连,形成封闭的环状结构,可以抵抗核酸外切酶的降解,比线性RNA更为稳定。circRNA主要通过吸附miRNA发挥基因表达调控作用,circRNA结构中富含miRNA应答元件(miRNA response element,MRE),可充当竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)与 miRNA 结合,吸附 miRNA,在细胞中起到miRNA海绵(miRNA sponge)的作用,下调miRNA的表达,进而解除miRNA对下游靶基因的表达抑制作用,上调靶基因的表达。目前circRNA在肺动脉重塑中的研究甚少,本研究中,我们发现慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者外周肺动脉存在明显重塑,且经过circRNA芯片及实时荧光定量PCR检测发现在COPD及非COPD患者外周肺组织中存在明显差异表达的circRNA,其中hsa_circ_0045462在COPD患者外周肺组织中显著高表达,进一步通过荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术定位hsa_circ_0045462在外周肺组织中的表达部位,发现其主要表达于外周肺动脉中膜。因此,我们推测hsa_circ_0045462可能参与了 COPD肺动脉重塑过程。根据生物信息学预测,hsa_circ_0045462与miR-486-5p之间存在互补碱基序列,可能调控miR-486-5p的表达。近期研究表明miR-486-5p可通过调控PASMCs及肺动脉内皮细胞(Pulmonary artery endothelial cells,PAECs)的迁移及细胞间的相互作用参与肺动脉重塑,但具体机制不详。细胞迁移诱导蛋白(cellmigration-inducingprotein,CEMIP)是重要的促癌基因,CEMIP的高表达与多种肿瘤细胞的过度增殖、凋亡抑制及侵袭密切相关。多个研究已经证实 CEMIP 的3’端非编码区(3’UntRNAslated Regions,3’UTR)存在 miR-486-5p的互补碱基序列,miR-486-5p可通过下调CEMIP的表达抑制肿瘤细胞的增殖及迁移、促进其凋亡。那么miR-486-5p能否通过下调CEMIP的表达参与PASMCs的增殖、凋亡调控,目前尚无相关研究报道。因此,我们以人PASMCs为研究对象,通过细胞转染、双荧光素酶实验等方法,初步探讨hsa_circ_0045462/miR-486-5p/CEMIP信号轴对PASMCs增殖、凋亡的影响及机制;旨在为肺动脉高压的诊治提供新的靶点,为临床转化应用提供一定的理论基础和依据。第一部分 COPD肺动脉重塑相关circRNA表达谱分析及筛选研究目的初步探索circRNA在COPD患者外周肺动脉中的表达。研究方法1.收集2016年1月至2018年12月在苏州大学附属第一医院因肺减容或肺癌行手术治疗的20例COPD及15例非COPD患者的外周肺组织标本及性别、年龄、吸烟状况、肺功能及动脉血氧分压等临床资料。获取的肺组织标本远离肿瘤(至少5cm)。COPD的诊断符合慢性阻塞性肺疾病诊治指南。2.通过HE染色及免疫组化法(α-SMA)检测COPD及非COPD组患者外周肺动脉管壁厚度与外径的比值及肌化血管比例。3.基因芯片(humancircularRNA array V2.0)检测COPD与非COPD组患者外周肺组织中差异表达的circRNA,并通过实时荧光定量PCR方法进行验证,筛选出目标circRNA,并采用FISH法定位目标circRNA的表达部位。4.通过对差异表达的circRNA亲本基因GO(Geneontology)及KEGG-pathway分析,初步探讨circRNA与COPD肺动脉重塑的关系。研究结果1.与非COPD组相比,COPD组患者外周肺动脉管壁厚度与外径的比值显著增高(p<0.001)、肌化血管比例显著增高(p<0.001)。2.与非COPD组相比,COPD组患者外周肺组织中circRNA的表达存在明显差异,共有表达下调的circRNA 130条,表达上调的circRNA 97条;经实时荧光定量PCR验证,选取的 4 条表达最高的 circRNA 中 hsa_circ_0002970(p<0.01),hsa_circ_0008199(p<0.01)以及hsa_circ_0045462(p<0.001)在COPD患者外周肺组织中的表达均较非COPD组增高,其中hsa_circ_0045462高表达最为显著。而hsa_circ_0004893的表达两组间无显著差异(p>0.05)。3.荧光素标记的hsa_circ_0045462与α-SMA在COPD患者外周肺组织中的表达部位基本一致,提示hsa_circ_0045462主要表达于外周肺动脉中膜。4.circRNA亲本基因GO及KEGG pathway分析提示差异表达的circRNA可能与核酸代谢、蛋白代谢、细胞周期及有丝分裂调控等过程有关。研究结论1.COPD患者存在明显的肺动脉重塑。2.Hsa_circ_0045462在COPD患者外周肺动脉中膜表达升高,可能与COPD肺动脉重塑相关。第二部分 Hsa_circ_0045462/miR-486-5p/CEMIP 在低氧诱导的人PASMCs增殖、凋亡调控中的作用研究目的探讨hsa_circ_0045462在低氧诱导的人PASMCs增殖调控中的作用及机制。研究方法1.通过实时荧光定量PCR检测低氧诱导的人PASMCs中hsa_circ_0045462的表达;CCK-8检测PASMCs的增殖,TUNEL检测PASMCs的凋亡。2.通过生信预测hsa_circ_0045462与miR-486-5p存在调控关系,并行双荧光素酶实验验证。3.采用 hsa_circ_0045462 特异性小干扰 RNA(si-has_circ_0045462)转染低氧诱导的 PASMCs;荧光定量 PCR 检测 hsa_circ_0045462、miR-486-5p 的表达;CCK-8 检测PASMCs的增殖,TUNEL检测PASMCs的凋亡。4.通过生信预测miR-486-5p与CEMIP存在调控关系,并行双荧光素酶实验验证。5.采用 miR-486-5p mimics、miR-486-5p inhibitor 转染 PASMCs,Western Blot 法检测CEMIP的表达;CCK-8检测PASMCs的增殖,TUNEL检测PASMCs的凋亡。6.采用 si-circ_0045462及 miR-486-5p inhibitor 共同转染低氧诱导的 PASMCs;Edu检测PASMCs的增殖,TUNEL检测PASMCs的凋亡;Western Blot法检测CEMIP的表达。研究结果1.低氧组(O2:3%,24h)PASMCs的增殖较常氧组(O2:21%,24h)显著增加(p<0.001),凋亡显著减少(p<0.001)。2.低氧组(O2:3%,24h)PASMCs 中 hsa_circ_0045462 的表达较常氧组(O2:21%,24h)显著升高(p<0.001)。3.双荧光素酶实验结果显示:与miR-NC组相比,miR-486-5p共转染组PASMCs中,hsa_circ_0045462-WT的相对荧光素酶活性显著下降(p<0.01),而hsa_circ_0045462-MT的相对荧光素酶活性无显著变化(p>0.05)。4.在低氧(O2:3%,24h)诱导的 PASMCs 中干扰 hsa_circ_0045462 的表达后,miR-486-5p的表达显著升高(p<0.01),PASMC的增殖显著减少(p<0.001)、凋亡显著增加(p<0.001)。5.双荧光素酶实验结果显示:与miR-NC组相比,miR-486-5p共转染组PASMCs中,CEMIP-WT的相对荧光素酶活性显著下降(p<0.01),而CEMIP-MT的相对荧光素酶活性无显著变化(p>0.05)。6.低氧组(O2:3%,24h)PASMCs中miR-486-5p的表达较常氧组显著下降(p<0.001);miR-486-5pmimics 转染后,PASMCs 增殖显著减少(p<0.001),凋亡显著增加(p<0.001)。7.CEMIP在低氧(O2:3%,24h)诱导的PASMCs中的表达显著升高(p<0.001);miR-486-5p mimics 转染后,CEMIP 的表达显著降低(p<0.001),而 miR-486-5p inhibitor转染作用相反(p<0.001)。8.在低氧(O2:3%,24h)诱导的 PASMCs 中,miR-486-5p inhibitor 能逆转has_circ_0045462 干扰引起的 PASMCs 增殖抑制(p<0.001)、凋亡增加(p<0.001)以及CEMIP的表达下降(p<0.001)。研究结论1.低氧可通过上调hsa_circ_0045462在PASMCs中的表达,促进PASMCs增殖,抑制PASMCs凋亡。2.Hsa_circ_0045462可通过ceRNA机制下调miR-486-5p的表达,促进低氧诱导的PASMCs增殖、抑制其凋亡。3.CEMIP是miR-486-5p调控PASMCs增殖、凋亡的靶点。第三部分 CEMIP在低氧诱导的人PASMCs增殖、凋亡调控中的作用及机制研究目的CEMIP在低氧诱导的人PASMCs增殖、凋亡调控中的作用及其调控机制研究方法1.通过实时荧光定量PCR及Western Blot检测PASMCs中CEMIP的表达。2.采用CEMIP特异性小干扰RNA(si-CEMIP)转染低氧诱导的PASMCs,并通过 Western Blot 检测 PASMCs 中 CEMIP 的表达;Edu 检测 PASMCs 的增殖,TUNEL检测PASMCs的凋亡。3.通过Western Blot检测低氧诱导以及si-CEMIP转染的PASMCs中pAKT、cyclinD1及c-IAP2 的表达。4.采用 Western Blot 检测 si-hsa_circ_0045462 转染后 PASMCs 中 CEMIP、pAKT的表达。研究结果1.低氧组PASMCs中CEMIP mRNA(O2:3%,24h)的表达较常氧组显著升高(p<0.001);CEMIP 蛋白(O2:3%,24h、48h)的表达较常氧组显著升高(p<0.05)。2.在低氧(O2:3%,24h)诱导的PASMCs中干扰CEMIP的表达后,PASMCs增殖显著减少(p<0.001)、凋亡显著增加(p<0.001)。3.低氧组(O2:3%,24h)PASMCs 中 pAKT(p<0.001)、cyclinD1(p<0.001)及c-IAP2(p<0.001)的表达较常氧组显著升高;而干扰CEMIP表达后,pAKT(p<0.001)、cyclinD1(p<0.001)及 c-IAP2(p<0.001)的表达显著降低。4.在低氧(O2:3%,24h)诱导的PASMCs 中干扰hsa-circ_0045462 的表达后,CEMIP(p<0.001)及pAKT(p<0.001)的表达均显著降低。研究结论1.CEMIP可能通过激活AKT信号通路,促进低氧诱导的PASMCs增殖、抑制其凋亡。2.Hsa_circ_0045462通过ceRNA机制下调miR-486-5p的表达,上调CEMIP的表达,并通过激活AKT信号通路,促进低氧诱导PASMCs增殖、抑制PASMCs凋亡。
其他文献
现阶段的国家发展、城市建设过程中,管道工程所能够产生的影响力,表现出大幅度的提升特点,不同类型的工程建设,必须在一系列的通病防治策略上,进行良好的完善,确保在后续的施工和发展上,能够按照合理化的策略、标准,进行更好的创新。相对而言,自来水管道工程施工,得到了业界内的高度关注,很多通病的存在,都是长期积累的结果,应坚持在处置的力度上,做出更好的改善。文章就此展开讨论,并提出合理化建议。
期刊
随着当下发展水平的不断提升,科技、社会、经济的发展速度都不断加快,促进了人们生活水平的提升,给人们提供了更加优质的居住、生活、工作的环境,使得人们生活的幸福感不断提升。而自来水管道在人们的生活、工作、生产的过程中都发挥了十分重要的作用,可以更好的保证人们的日常用水,因此,相关部门对于自来水管道工程的施工质量提升了关注程度,工程方面的要求越来越高。同时,这也是现代化城市发展过程中的必然需求,当前城市
期刊
为研究不同养殖模式的克氏原螯虾(Procambarus clarkii)肉中游离氨基酸(free amino acids,FAA)的综合品质差异,以江苏兴化地区具有代表性的3大类养殖模式的克氏原螯虾尾肉为研究对象,测定FAA并结合滋味活性值(taste active value,TAV)分析各氨基酸在克氏原螯虾肉中的呈味特性,然后运用主成分分析(principal componentanalysi
期刊
自来水管道工程是城市基础建设中极其重要的组成部分,不仅在人们的生活和生产中发挥着重要作用,同时对我国经济的发展有着积极影响。想要保证自来水管道的服务水平,前提是需要加强提高自来水管道的工程质量。因此,施工单位需要高度重视自来水管道的施工问题,本文通过辽宁省沈阳市林业区自来水工程施工中的通病进行分析,并针对性的提出防治措施,希望通过本文的阐述能够为相关人士提供参考和借鉴,从而有效提升自来水管道工程的
期刊
近年来随着我国科研水平的不断提升,科研投入、科研数量都不断增加,新的科研成果也不断涌现,科研已成为推动社会经济发展的动力之一。科研管理作为科研工作的基础和保障,也面临更多挑战。然而事业单位的科研管理工作比较薄弱,存在很多管理问题阻碍了单位科研的发展,因此根据事业单位自身特点,解决科研管理相关问题显得尤为重要。
期刊
目的 探讨儿科病例教学在八年制临床医学生见习临床思维培训中的应用。方法 2022年1月3日-3月31日在医院儿科见习的2018级八年制临床医学生55名为研究对象。随机分为典型病例教学组28名,拓展病例教学组27名。自病例库选取病例,典型病例组给与典型病例教学,拓展病例组给与典型病例教学加拓展病例教学。采用符号秩和检验分析病例分析成绩,学生问卷调查方法分析病例教学认可度。结果 两组病例分析成绩均较理
期刊
计算机技术为人们传输数据信息提供了方便,这也是网络技术的优势,但在使用中也面临着安全风险,文章分析了计算机使用过程中产生数据信息风险的因素,并且阐释了加密技术在数据库、节点、链路、软件方面的作用。
期刊
以3个教学案例阐述了促进新课程高三化学学习困难学生的自我监控能力发展的策略:(1)课前学案导学,发现知识缺陷,提高学生的自我认识;(2)课堂多向交流,暴露思维过程,体验自我监控过程;(3)课后测评反馈,实施"一卷两改",培养学生学习活动后的自我监控能力;(4)测试讲评,实施"一题两讲",提高问题解决的自我监控能力。并说明实施上述策略的前提是相信学生、尊重学生和加强指导。
期刊
单一的桩基检测手段具有一定的局限性,无法全面客观分析,会产生漏判和错判的风险。通过阐明不同检测方法的原理,分析不同检测方法各自的适用范围。结合工程实例,采用声波透射法、低应变反射波法、钻芯法对灌注桩完整性进行检测,研究表明采用单一的检测手段评定桩基质量存在一定的风险,多种检测方法进行桩基质量综合评定才比较科学和公正。
期刊
研究目的:于2018-2020年对黑龙江省部分中小学进行了"冰雪运动进校园工作情况"的调研。此次调研的目的是了解黑龙江省各中小学开展冰雪运动的师资、场地及教学活动的现状,分析黑龙江省中小学开展冰雪运动教学的优势,厘清活动开展中的不足及其原因,从而进一步推动"冰雪运动进校园"工作。研究方法:本文采用探索性的多案例研究方法。首先,本文是一个"为什么""怎么做"和"怎么样"类型的研究;其次,本文关注的研
会议