前列腺癌在欧美国家是男性癌死亡的主要原因之一，其发病率随年龄增长。据统计，在全世界范围内中国人的前列腺癌发病率最低，但发现前列腺节段切片中病灶数与欧美地区相近，因此研究出治疗前列腺癌的有效方法刻不容缓。常见治疗方法中的手术切除、放射疗法、冷冻疗法、内分泌疗法，不仅让患者承担较大风险，并且有强烈的副作用。基因疗法虽然没有较强的副作用，但确定将某一基因作为潜在诊断和治疗的方向是非常关键的步骤，因此还需要对基因疗法进行有效的评估。基于常见治疗方法的各种局限性，有必要研究出更为安全有效的前列腺癌治疗方法。　　近年来研究的肿瘤疫苗是关于恶性肿瘤治疗的热点之一，其原理是通过激活患者本身原有的免疫系统，利用肿瘤细胞表面或肿瘤的抗原物质诱导患者机体产生的特异性体液免疫和特异性细胞免疫反应，增强患者的抗肿瘤杀灭肿瘤细胞的能力，进而抑制肿瘤细胞的生长、扩散、转移和复发，使之达到根治或控制肿瘤的目的。肿瘤细胞疫苗是从癌症患者机体的肿瘤组织中提取出可以致瘤的肿瘤细胞，经过射线照射或酒精固定等灭活处理后使肿瘤细胞失去原有的致瘤性，但仍然保持肿瘤细胞表面抗原本来的免疫原性，然后使灭活的肿瘤细胞诱导机体产生特异性免疫，进而对机体进行主动免疫。理论上肿瘤细胞可提供肿瘤抗原能诱导机体产生免疫应答，但肿瘤细胞免疫原性较低，不能有效的诱导产生较强的肿瘤免疫应答。因此，通常采用在制作的肿瘤疫苗中加入一种或几种能够诱导产生有效的免疫应答的细胞因子的方法，来增强和提高制作的肿瘤疫苗的免疫原性，其中以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF最为常用。　　粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF是一类能够产生调节造血细胞增殖和分化作用的细胞因子。在疫苗接种的部位，局部大量表达的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF能够提高抗原提呈细胞APC数量，从而有效地捕获、加工和提呈抗原给T细胞。而在肿瘤细胞疫苗中起到协同共刺激作用的分子，能够提供淋巴细胞T细胞活化所需的非特性的第二信号，促进肿瘤的免疫应答，因此我们创造性地提出肿瘤坏死因子TNFα。TNFα在体内、体外均能高效率的杀死某些肿瘤细胞，或抑制肿瘤细胞的增殖，是非常重要的免疫刺激因子，与GM-CSF联合应用有免疫协同效应。　　在本课题的研究中，我们已经自主生产出SA-hGM-CSF和SA-hTNFα两种蛋白，利用自主创新的细胞膜表面修饰技术平台，开发研制出了GM-CSF/TNFα双重膜表面修饰的LNcaP前列腺癌肿瘤疫苗。已成功建立hPBMC-NOD/SCID小鼠前列腺癌模型，并用GM-CSF/TNFα双重膜表面修饰的肿瘤疫苗治疗该肿瘤模型。　　目的:　　(1)用SDS-PAGE凝胶鉴定双功能融合蛋白SA-hGM-CSF和SA-hTNFα是否已经制备成功;　　(2)用流式细胞术鉴定SA-hGM-CSF和SA-hTNFα在已灭活并生物素化的LNcaP肿瘤细胞膜表面的锚定率;　　(3)分别用小鼠成纤维细胞株L929检测SA-hTNFα的活性，用人红白血病细胞株TF-1检测SA-hGM-CSF的活性，及其锚定在肿瘤细胞膜表面的肿瘤疫苗的活性;　　(4)hPBMC-NOD/SCID小鼠皮下肿瘤模型的建立和鉴定;　　(5)肿瘤疫苗对hPBMC-NOD/SCID小鼠皮下肿瘤模型治疗效应的鉴定。　　方法:　　(1)分别生产制备有活性的SA-hGM-CSF和SA-hTNFα双功能融合蛋白;　　(2)分别生产制备有活性的肿瘤疫苗:收集LNcaP细胞悬液，生物素锚定在细胞膜表面，SA-hGM-CSF/SA-hTNFα蛋白与生物素结合，继而蛋白锚定在细胞膜表面;　　(3)建立hPBMC-NOD/SCID小鼠模型，在小鼠背部的皮下注射LNcaP肿瘤细胞（5×105个/mouse），将小鼠分为GM-CSF/TNFα双锚定组、GM-CSF单锚定组、TNFα单锚定组、固定细胞组、PBS组。根据分组，在皮下注射肿瘤细胞后的第0、7、14天后分别给小鼠腹腔注射疫苗(2×106个/mouse);　　(4)检测小鼠外周血中是否有hCD4+T细胞、hCD8+T细胞浸润，观察小鼠的生存状况、肿瘤的增长状况小鼠的生存率，检测肿瘤、脾脏、肝脏、淋巴结组织中hCD4+T细胞、hCD8+T细胞的浸润情况，检测小鼠肝脏损伤状况，判断小鼠模型是否出现移植物抗宿主病GVHD。　　结果：　　(1)纯化、复性后的SA-hGM-CSF和SA-hTNFα双功能融合蛋白，经过SDS-PAGE凝胶电泳后鉴定，复性后的蛋白可以形成多聚体结构。使用敏感细胞株分别测活鉴定，复性后的蛋白在体外有活性;　　(2)流式细胞术鉴定SA-hGM-CSF和SA-hTNFα双功能融合蛋白可以有效地锚定在已灭活的LNcaP肿瘤细胞膜表面，且锚定率达到70％以上;　　(3)使用敏感细胞株分别测活鉴定已制备的肿瘤疫苗的活性，证明肿瘤疫苗在体外有活性;　　(4)人外周血单个核细胞移植入NOD/SCID小鼠腹腔4周后，流式细胞仪鉴定人外周血中的CD4+T细胞、CD8+T细胞已转移到小鼠外周血中。免疫组织化学分析鉴定显示，在不同治疗组的小鼠的肿瘤肿瘤、脾脏、肝脏、淋巴结组织中有不同程度的CD4+T细胞、CD8+T细胞浸润，GM-CSF/TNFα双锚定组浸润T细胞数量最多，且没有出现移植物抗宿主病;　　(5)三次疫苗注射一周后，GM-CSF/TNFα双锚定组有2只小鼠存活(2/5)，GM-CSF单锚定组有1只存活(1/5)，TNFα单锚定组有1只小鼠存活(1/5)，固定细胞组有1只小鼠存活(1/3)，PBS组全部死亡(0/3);　　(6)GM-CSF/TNFα双锚定组小鼠肿瘤的横截面积明显比其他治疗组的小。　　结论：　　GM-CSF/TNFα双锚定组肿瘤疫苗更能提高CD4+T细胞、CD8+T细胞浸润到小鼠模型的外周血和各种免疫器官，并能提高小鼠的生存率。