朊病毒病(Prion disease),又称可传播性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies, TSEs),是由具有感染性的PrPsc蛋白粒子感染哺乳动物神经系统,并造成严重的神经病理损伤的致死性神经系统退行性疾病。目前哺乳动物中发现的朊病毒病,包括人类的克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、GSS综合症(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome, GSS)、Kuru病、家族性致死性失眠症(fatal familial insomnia, FFI),以及动物的羊瘙痒病(Scrapie)、牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopathy, BSE)和鹿的慢性消耗性疾病(chronic wasting disease,CWD)等。20世纪90年代,Prusiner等研究证实,引发朊病毒病的朊病毒(又称朊粒)是机体正常表达的PrpC蛋白通过构象转换(其二级结构由富含α螺旋转换为富含p折叠的构象),形成具有感染性和复制能力的prpSc分子。由于正常PrPC蛋白的生物功能未知,机体内大量增殖的prpSc分子及其致病机制一直是朊病毒病研究的热点。概括来讲,宿主细胞内大量复制的PrPSc分子,一方而可以引起细胞调控网络紊乱(Aberrant of Regulation Network),并最终造成广泛的细胞凋亡和神经元的丢失(组织学称为“海绵状空泡”)；另一方面,prpSc分子在造成细胞损伤的过程中,往往通过与细胞内其他分子的协同作用或影响其他蛋白分子的正常功能,从而造成细胞凋亡通路或自噬通路的激活,引发细胞损伤。蛋白质二硫键异构酶(Protein disulfide isomerase, PDI)是一种真核细胞中普遍存在,并锚定于内质网内腔中的分子伴侣蛋白,属于硫氧还原蛋白超家族(Thioredoxin superfamily)成员。PDI的酶催化活性结构域由53-56位、及379-400位的‘’CGHC"基序组成。研究表明,PDI蛋白在哺乳动物脑组织中有大量表达,并在神经元(Neuron)保护和神经退行性疾病中发挥重要作用。例如,在AD和PD等神经退行性疾病中,PDI表达处于上调状态,其酶活性处于受抑制状态。目前,尚未有PDI蛋白在朊病毒病致病机制中的功能研究。基于以上现状,本研究采用羊瘙痒因子263K颅内感染仓鼠的脑组织,突变型PrP转染的HEK293细胞模型为研究对象,利用蛋白免疫印记,细胞免疫荧光,Biotin-Switch-Test, Caspase-3酶活检测,以及线粒体功能检测等为研究手段,开展PDI蛋白参与调节朊蛋白相关内质网应激和线粒体功能异常的机制研究。本研究的主要结果如下：1.利用263K感染仓鼠脑组织以及PDI多克隆抗体检测朊病毒病发病过程中,PDI蛋白的表达水半。结果显示,PDI蛋白及其同源物Grp58在263K感染终末期表达明显异常上调；内质网应激反应标志物Grp78和细胞凋亡标志物Caspase-3均出现异常表达,并说明在263K感染终末期,脑组织细胞有严重的内质网应激压力(Endoplasmic Reticulum Stress, ER stress)和细胞凋亡(Apoptosis)激活。此外,利用感染不同时间点的263K仓鼠脑组织及以上标志物(Hallmark)的动态检测,结果表明,感染后20天(dpi20days) PDI蛋白即开始出现上调表达,并持续至60天,伴随有细胞凋亡通路的活化和内质网应激反应。2.利用野生型及突变型PrP质粒(PrP-WT, PrP-KDEL, PrP-PG15)转染HEK293细胞并进行细胞免疫荧光实验,研究突变型PrP蛋白与PDI蛋白胞内共定位。结果显示,野生型PrP蛋白主要定位于细胞膜表面,以及部分胞浆内；而突变型PrP蛋白则表现出不同的运输和代谢类型(Traffic and metabolism)。进一步分析发现,转染PrP-KDEL与PrP-PG15的细胞在内质网中形成斑块样的PrP蛋白聚集。CCK-8细胞毒性检测以及Western blot检测表明,突变型朊蛋白可诱导特异性的细胞毒性,并激活内质网应激反应和细胞凋亡通路的活化。此外,细胞免疫荧光实验表明,内质网内聚集的突变型PrP蛋白和PDI蛋白具有胞内共定位信号。3.将突变型PrP质粒和hPDl(人源全长PDI基因)质粒共转染HEK293细胞,研究PDI蛋白对突变型PrP蛋白细胞毒性的影响。结果显示,PDI蛋白可以显著缓解PrP-KDEL、PrP-PG15造成的细胞毒性,并产生以影响Caspase-12活化为代表的内质网应激保护效应。4.利用合成的RNAi oligos干扰HEK293细胞的本底PDI蛋白的表达,研究PDI对PrP蛋白细胞毒性的影响。结果显示,干扰PDI蛋白表达可以部分缓解PrP-PG15造成的细胞毒性,并以影响Caspase-3活化、上调Grp78为代表产生一定的细胞保护作用。5.通过线粒体异常功能研究,探讨PDI蛋白影响突变型PrP蛋白细胞毒性的分子机制。结果显示,突变型PrP蛋白的表达造成细胞线粒体膜电位和功能的紊乱；PDI蛋白通过影响线粒体细胞色素C的释放,以及Caspase-3酶活,影响突变型PrP蛋白诱发的细胞毒性。6.利用生物素开关实验(Biotin-Switch-Test),探讨PDI蛋白的亚硝基化修饰对于其参与调节PrP蛋白细胞毒性的影响。结果显示,在263K感染仓鼠的脑组织中,PDI蛋白有特异性的亚硝基化修饰；突变型PrP蛋白PrP-KDEL和PrP-PG15均可以诱导细胞内PDI蛋白发生亚硝基化修饰；通过加入亚硝化修饰的阻断齐L-NMMA抑制突变型PrP蛋白相关的PDI亚硝基化修饰,可以缓解突变型PrP蛋白细胞毒性。总之,本研究利用263K感染的仓鼠脑组织以及表达突变型PrP蛋白的HEK293细胞,运用蛋白质免疫印迹、线粒体功能分析等方法揭示了PDI蛋白在朊病毒病中参与调节疾病相关的内质网应激、线粒体功能异常以及细胞凋亡通路的活化机制,并首次提出PDI亚硝基化修饰对于PDI参与调节异常朊蛋白引起细胞毒性的重要作用。