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炎症是十分常见而又重要的病理过程,适度的炎症反应有益于机体健康,但反应过度或者缺乏都会引起机体的不良反应甚至导致死亡。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)可刺激RAW264.7细胞产生急性炎症反应,可依此构建体外炎症研究模型。炎症反应过程中细胞会释放一氧化氮(Nitric oxide,NO)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)等多种炎症因子,这些因子可参与调控机体炎症的发生发展,其含量可间接反应炎症发生的程度。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号通路和核因子κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路是炎症反应中重要的信号级联途径,活化后的信号通路可调控多种炎症因子的mRNA转录和蛋白表达,是许多抗炎药物的关键作用对象。化橘红是一种具有抗炎止咳功效的传统中药,但其研究多集中在主要成分的提取和分析方面,具体抗炎机制研究有待完善。化橘红主要成分为黄酮类、多糖、挥发油等,化橘红黄酮中的柚皮苷被视为化橘红药效的指标成分。因此,本研究主要以化橘红醇提物为研究材料,对总黄酮和柚皮苷的含量进行测定,并采用UPLC-Q-TOF-MS/MS对化橘红黄酮的主要成分进行分析。选取适宜浓度的LPS刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞构建体外炎症模型,采用Griess法、酶联免疫吸附法(ELISA)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对NO、TNF-α、ILs等进行测定,以此为指标评价不同浓度化橘红黄酮的抗炎效果。采用Western blot法研究化橘红黄酮对RAW264.7细胞MAPK和NF-κB信号通路中重要蛋白的影响。进一步验证化橘红黄酮对NF-κB信号通路的调控作用,采用共聚焦免疫荧光法对RAW264.7细胞中NF-κB p65蛋白的核转移进行研究。本研究主要结果如下:(1)采用醇提法提取化橘红黄酮,提取条件为:乙醇体积分数70%,料液比1:60(m:V),50℃水浴浸提5.5h,。化橘红黄酮经AB-8大孔树脂纯化后,总黄酮含量可达88.37%,HPLC测定提取物中柚皮苷含量占总黄酮含量的72.45%。为进一步分析化橘红黄酮主要成分,优化得到UPLC梯度洗脱条件:1.5min,90%A;2.0min,75%A;6.0min,60%A;12min,45%A;15min,20%A;19min,0%A;20min,95%A。其中流动相A为0.1%的甲酸水溶液,流动相B为乙腈。UPLC测定得到化橘红黄酮2个主峰的保留时间为12.008min和13.611min。采用负离子模式对化橘红黄酮进行UPLC-Q-TOF-MS/MS测定,确定UPLC中2个主峰对应的分子量依次为580和578,根据母离子和碎片离子特征推测化橘红黄酮中的主要成分为柚皮苷和野漆树苷。(2)MTT法测定系列浓度化橘红黄酮对RAW264.7巨噬细胞的细胞毒性,筛选出5μg/mL、20μg/mL、80μg/mL作为化橘红黄酮低、中、高剂量。综合考察不同浓度LPS对RAW264.7巨噬细胞的细胞毒性及其对细胞NO分泌量的影响,选择1μg/mL LPS作为刺激浓度构建RAW264.7细胞体外炎症模型。在预防模式、治疗模式和共作用模式下,5μg/mL、20μg/mL、80μg/mL的化橘红黄酮对RAW264.7细胞的NO分泌量有不同程度的抑制作用;不同剂量的化橘红黄酮在作用4h、12h、24h和48h后,对细胞中的NO分泌量均有一定的抑制作用。对RAW264.7细胞中的NOS酶活力进行测定,与LPS组比较,高剂量的化橘红黄酮可显著降低NOS酶活力(P<0.05)。5μg/mL、20μg/mL、80μg/mL的化橘红黄酮对TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎细胞因子均有不同程度的抑制作用,而对抑炎细胞因子IL-10有显著的促进作用。(3)qRT-PCR测定结果显示,5μg/mL、20μg/mL、80μg/mL的化橘红黄酮对TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA均有不同程度的下调作用,对IL-10的mRNA有一定的上调作用。采用Western Blot法检测MAPK信号通路和NF-κB信号通路中的相关蛋白,探究化橘红黄酮可能存在的抗炎机制。LPS刺激RAW264.7细胞后p38、ERK1/2、JNK1/2均发生了极显著的磷酸化(P<0.01);与LPS组比较,5μg/mL、20μg/mL、80μg/mL的化橘红黄酮不同程度地降低了细胞中p-p38、p-ERK和p-JNK的含量,对MAPK通路中重要蛋白的磷酸化产生了抑制作用。与空白组比较,RAW264.7细胞在受到LPS刺激后IκB含量有极显著降低(P<0.01)。化橘红黄酮作用后,与LPS组比较,20μg/mL和80μg/mL的化橘红黄酮可显著增加RAW264.7细胞中IκB的含量(P<0.01)。进一步探究高剂量化橘红黄酮对NF-κB信号通路活化的影响,借助免疫荧光共聚焦显微镜观察NF-κB/p65在RAW264.7细胞核内外的染色情况,结果显示LPS刺激可引起细胞的膨大分化并促进p65蛋白向细胞核内转移,而80μg/mL的化橘红黄酮可有效抑制p65的核转移,进而抑制NF-κB信号通路的活化。