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根尖周炎是由细菌感染引起的根尖周软硬组织破坏为特征的免疫炎症反应,该局部炎症反应包括招募多种炎性细胞,促进炎性因子的分泌,破坏成骨细胞破骨细胞的动态平衡,最终导致根尖周牙周纤维的溶解和骨质的破坏。近年来,为了深入探究根尖周炎的发病机制,日趋增多的研究发现该局部炎症反应包含多种炎性细胞有中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、浆细胞、淋巴细胞和T细胞等;多种炎性因子有本课题组已经验证过的RANKL,IL-17,CX3CL1,S1P1和MMP-9等。然而,具体的机制涉及到骨代谢和炎性物质的形成以及参与其中的细胞和因子仍未被完全详细阐明;根尖周炎中肉芽肿及囊肿的形成机制仍不明朗。深入研究根尖周炎的发病机制有利于未来根尖周病的治疗及预后。Cyclophilin A(CypA)是一种具有多种生物学功能的调节因子,可以参与调节机体的多种炎症反应和免疫调节反应。其可以由多种细胞表达并对多种炎性细胞包括中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞等有强劲的趋化作用;调控包括MMPs在内的多种炎性因子的分泌。近年来,多种疾病研究发现CypA参与其发病机制,包括心血管疾病、类风湿性关节炎、病毒感染、肿瘤和败血症等,而在口腔根尖周病这一领域并没有深入研究。本课题分别在人及小鼠和体外细胞三个部分初步研究CypA在根尖周炎中的表达及调控作用。第一部分CypA在人根尖周炎中的表达情况研究目的:检测CypA在人根尖周炎不同病理类型中的表达,依表达情况分析研究CypA与根尖周炎中血管新生,炎性细胞浸润及软硬组织破坏的关系。方法:收集选取58例人根尖周炎样本,包括根尖肉芽肿(PG,n=28),根尖囊肿(RCs,n=24),和人健康对照组组织(n=6)。样本固定后进行分析,通过使用免疫组织化学的方法检测分析CypA在不同样本切面的表达情况;使用双免疫荧光实验评价分析CypA与CD34、CypA与MMP-9以及CD147与MMP-9共定位表达的关系。结果:从免疫组织化学染色可以发现,相比较对照健康组织CypA在人根尖周病损组织囊肿肉芽肿中高表达,CypA在囊肿肉芽肿两组间表达没有统计学差异。CypA阳性细胞主要是淋巴细胞、浆细胞、血管内皮细胞及上皮细胞。双免疫荧光染色分析CypA与CD34表达情况发现CypA与CD34在血管壁高度重合,且与正常对照组相比具有统计学意义,说明CypA可能与根尖周炎中血管新生有关。MMP-9同时与CypA和CD147共定位表达间接说明CypA可能与CD147共定位,且CypA/CD147相互作用可能与根尖周炎中软硬组织降解有关。结论:CypA在人根尖周病损中表达并可能通过趋化炎性细胞浸润、促进血管新生和牙槽骨吸收参与人根尖周病损的发展。第二部分CypA在实验性小鼠根尖周炎体内及体外细胞实验研究目的:为深入了解CypA在根尖周炎中的作用及与骨质破坏的关系,本课题组在小鼠实验性根尖周病变过程中体内检测CypA蛋白的表达及变化,分析其与相关炎性因子表达量及根尖骨质破坏的关系;体外实验研究抑制CypA对成骨细胞破骨细胞分化及相关因子和信号通路表达情况的研究。方法:体内实验:40只C57BL/6J小鼠分为八组,在下颌第一磨牙进行开髓建立小鼠根尖周炎模型,分别在0,7,14,21,28,35,42和49天处死。收集小鼠下颌骨并经骨密度仪和micro-CT扫描后制成组织切片,随后进行组织学,免疫组织化学,酶免疫化学和双免疫荧光染色分析相关蛋白的免疫表达情况。体外实验:使用CypA抑制剂Cs A分别作用于MC3T3-E1和RAW264.7,在伴有或不伴有LPS刺激条件下使用Western blot技术分析成骨相关蛋白和破骨相关蛋白的表达,以及相关信号通路蛋白的表达。结果:体内试验中,小鼠根尖周病损从0天增大到第42天,随即趋于稳定大小到第49天。免疫组织化学染色显示CypA的表达水平从0天开始增长,到第35天到达峰值。CypA的表达量与破骨细胞数(R2=0.5101,P<0.05),CD147表达水平(R2=0.4423,P<0.05)和MMP-9表达水平(R2=0.4715,P<0.05)正相关。连续切片免疫组织化学染色进一步确认CypA与CD147在破骨细胞上共定位表达;免疫双荧光染色显示CypA阳性细胞和CD147阳性细胞同时与MMP-9阳性细胞重叠分布。体外实验使用CypA抑制剂Cs A在有LPS刺激的条件下,成骨细胞系MC3T3-E1相关标记蛋白NFATc-1、MMP-9、p-STAT3和CD147蛋白表达下降(P<0.05);破骨细胞系RAW264.7中CD147、MMP-9和p-STAT3蛋白表达均下降(P<0.05)。结论:实验发现CypA在小鼠根尖周病损各个时期都有表达说明CypA参与小鼠根尖周病损的发生发展。CypA与JAK2/STAT3信号通路活化有关,抑制CypA可以抑制JAK2/STAT3信号通路磷酸化。CypA可以调节成骨细胞上NFATc-1的表达,同时,CypA与破骨相关的MMP-9表达情况紧密相关,因此,CypA可能参与骨质代谢,抑制CypA相关的信号通路可能对未来阻断并治疗炎性骨吸收有益。