江苏地区鲫出血病病原的分离、鉴定及检测方法研究

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鲫(Crassius auratus)与金鱼(Carassius auratus L.)约亲缘关系较近,作为我国淡水养殖的名优品种,养殖规模和养殖潜力越来越大,然而罕有关鲫病毒病方面的报道。鲤科疱疹病毒2型(CyHV-2),又称为疱疹造血器官坏死病毒(HVHNV)或金鱼造血器官坏死病毒(GFHNV),是一种可感染金鱼的致病原。1992年秋季和1993年春季在日本西部养殖的金鱼暴发疱疹病毒性造血器官坏死病,造成的死亡率几乎达到了100%,这是有关该病的首次报道。在此之后美国、台湾、澳大利亚、英国和新西兰相继有该疾病暴发的报道。这些报道表明鲤科疱疹病毒2型在金鱼中广泛传播。2011-2012,国内某些异育银鲫(Carassius aurutus gibelio)养殖的主要产区出现暴发性疾病,发病鱼体表充血腹部肿胀,眼眶基部充血,鳃丝严重出血并发白,肌肉出血,脾肾有程度不一的出血,肝脾肿大,鳔出现点状出血。为查明病因对发病鱼进行病原鉴定分析,显微镜镜检未发现寄生虫感染;用从病鱼病灶组织分离得到的细菌进行人工回染试验,20天内试验鱼无死亡;电镜下观察到发病鱼病灶组织细胞内有大量不同生长期的球形病毒颗粒,病毒粒子有囊膜,直径在90~170nm;提取病鱼组织核酸,鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、金鱼造血器官坏死病毒(GFHNV)的特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR),结果只有GFHNV引物扩增出特异性的基因片段,测序结果表明其与GFHNV的参考序列有99%的相似性。用出现典型症状发病鱼的组织上清人工感染健康异育银鲫,试验鱼在3d后陆续发病死亡,患病症状同自然发病症状,并从感染鱼组织中检测到GFHNV;将处理的病样上清液接种在锦鲤鳍条细胞(KF)中7天后出现明显的细胞病变(cytopathic effects, CPE),同时在经过两代盲传后的细胞经过PCR检测也获得了GFHNV阳性目的片段,并在电镜下观察到病毒粒子。根据上述结果,判定本次异育银鲫暴发性疾病病因是GFHNV感染。为进一步研究病毒特性,作者以典型症状发病鱼组织匀浆液腹腔注射或浸泡对健康异育银鲫进行该病毒生物学特性研究,得出GFHNV的宿主范围包括金鱼和鲫鱼的普通变种,最适感染温度20-25℃;GFHNV对异育银鲫不同鱼龄均有致病力,但幼鱼比咸鱼更易感,且死亡高峰期提前。运用石蜡包埋及制备组织病理切片对患病鲫的鳃、脑、脾、肾、肝胰脏、肠等多个组织进行病理学研究,同时对其治病机理进行初步分析。该病症主要表现为靶器官细胞出现肿胀、变性、增生的坏死现象,部分细胞核出现萎缩、深染,血细胞渗出。建立了GFHNV的LAMP荧光检测技术,该法的最低检出限4.6×103copies/μL,对锦鲤疱疹病毒、鲤春病毒血症病毒、病毒性神经坏死病毒等无交叉反应,有良好的灵敏性和特异性,可应用于发病异育银鲫早期快速诊断及养殖异育银鲫的病原检测。
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