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一、微移植联合地西他滨治疗MDS患者的回顾性临床观察目的:通过临床观察分析微移植联合DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨对骨髓增生异常综合征的疗效和安全性。材料和方法:回顾分析2009年9月至2016年9月广东省人民医院血液内科单独应用常规剂量地西他滨或微移植联合地西他滨治疗的22例骨髓增生异常综合征患者的临床资料,患者主要通过骨髓活检、骨髓细胞学、染色体核型分析、以及基因学等确诊,且评分均>3分(中危及中危以上)其评分标准按照国际预后评分系统修订的最新版本(Revised International Prognostic Scoring System,IPSS-R),每例 MDS 患者完成至少2个疗程的地西他滨去甲基化治疗或者至少2个疗程的微移植治疗。22例患者均给予常规剂量地西他滨20mg/m2/d维持1小时静脉输注,应用5天,4周为1个疗程。统计分析并评价微移植联合地西他滨治疗对MDS的临床疗效和不良反应发生情况,以及与单药地西他滨同等剂量对MDS的疗效比较,跟踪随访患者的生存时间,比较两组患者的生存时间。结果:微移植(MST)组中9例患者(9/11,81.8%)对治疗有反应,在地西他滨组(DAC)组中6例(6/11,54.5%)患者出现了反应,两组间无显着性差异(P=0.18),但MST组的总反应率(ORR)以及骨髓完全缓解率(mCR)和血液学改善(HI)同时达到的比例均高于DAC组(81.8%&54.5%,P=0.09;63.6%vs.18.2%,P=0.18)。MST组12个月AML转化的发生率低于DAC组(0.0%vs.27.3%,P=0.07)。同时,MST组24个月的死亡发生率低于DAC组(45.5%vs.81.8%,P=0.08)。MST组中位OS为24个月,DAC组中位OS为14.3个月;两组差异显著(HR 0.34;95%CI 0.12-1.01;P=0.04)。MST 组的中位 PFS 为 24.0 个月,DAC 组 17.9 个月(HR 0.47;95%CI 0.12-1.83;log-rank test,P=0.25),两组无明显统计学差异。同时,对22例地西他滨或联合微移植治疗的患者的安全性进行评估,在治疗的前12个月中,MST组死亡1例(1/11,9.1%),DAC 组死亡 4 例(4/11,45.4%)(P=0.14);MST 组 24 个月死亡率为 5/11(45.5%),DAC组中为9/11(81.1%)(P=0.08)。在整个治疗期间,除血小板减少外(MST组为64%,而DAC组为27.0%,P=0.09),MST组患者的血液学不良反应(AEs)发生率均较低(贫血:MST组27.2%vs.DAC组55.0%,P=0.20;白细胞减少:MST组54.5%vs.DAC 组 73.0%,P=0.39;中性粒细胞减少:MST 组 55.0%vs.DAC 组 64.0%,P=0.67)。在MST组中在非血液学AE中发现了相同的结果。同时肿瘤负荷指标WT1上调和下降的波动趋势与治疗反应一致。结论:微移植联合地西他滨治疗中高危MDS与单用地西他滨治疗相比能够显著提高患者的生存期,改善血液学AE和非血液学AE的发生率,以及减少白血病转化率和死亡率。二、微移植治疗MDS患者机制的初步研究——MDS患者γδ T细胞亚群分析及其表面蛋白BTLA/HVEM表达的初步研究目的:证据表明T细胞免疫紊乱在MDS的疾病中发挥重要作用,本研究旨在探究MDS患者γδ T细胞亚群和其表面蛋白BTLA/HVEM的表达。材料和方法:收集MDS患者微移植治疗前以及正常供者的骨髓和外周血样本。采用流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞、γδ T细胞、Vδ1细胞、Vδ2细胞、CD27+和CD27γδT细胞的水平以及T淋巴细胞和γδT细胞表面BTLA及其配体HVEM的表达水平;实时定量PCR检测不同类型MDS患者BTLA、以及HVEM mRNA表达水平,分析MDS患者γδ T细胞异常与BTLA表达的关系。体外γδT细胞的培养、扩增及功能检测:分离患者外周血单个核细胞,建立体外γδ T细胞培养体系,诱导扩增γδT细胞,检测MDS患者γδT细胞的增殖能力、杀伤活性。结果:1.流式细胞术检测MDS患者和正常供者外周血γδ T细胞及其亚群的表达:1.1 RAEB患者外周血γδ T细胞水平为2.94(0.68-7.37)%,明显低于正常对照水平5.74(1.38-10.04)%。Vδ2 T细胞亚群较正常对照有升高趋势(P=0.052)。γδ T细胞中CD27+与CD27-细胞亚群较正常对照呈降低趋势(P=0.062,P=0.058),而RAEB患者CD27+细胞比例略高于CD27细胞;正常对照CD27+细胞比例略低于CD27-细胞。1.2 CMML患者外周血T淋巴细胞水平32(7.14-76.38)%(P<0.05),较对照组明显降低;Vδ1T细胞具有升高的趋势(P=0.063)。2.流式细胞仪检测外周血T细胞和γδ T细胞表面BTLA及其配体HVEM的表达水平:CMML患者外周血γδ T细胞BTLA的表达明显降低(P=0.029),其配体HVEM的表达有升高趋势(P=0.118),差异无统计学意义。3.实时定量PCR检测不同类型MDS患者BTLA和HVEM mRNA的表达水平:3.1 32例不同类型MDS患者同期骨髓与外周血BTLA、HVEM mRNA的表达水平均明显高于骨髓(P<0.01)。3.2不同类型MDS患者BTLA、HVEM mRNA表达水平:(1)BTLA的表达:与正常对照相比,RCMD患者外周血BTLA mRNA的表达水平明显高于正常对照(P=0.003),RAS患者外周血BTLA mRNA的表达水平明显低于正常对照(P=0.011)。RCMD患者外周血BTLA mRNA的表达水平明显高于其他类型MDS患者(P<0.05),而RAS患者外周血BTLA mRNA的表达水平明显低于其他类型MDS患者(P<0.01)。骨髓BTLA mRNA的表达水平,RAEB-1和RAEB-2患者均明显低于正常对照(P<0.05)。(2)HVEM的表达:RAEB-1和RAEB-2患者外周血HVEM mRNA的表达水平明显低于正常对照(P<0.05),RCMD患者与正常对照无明显差异(P=0.297),但明显高于 RAEB-2 患者(P=0.018)。3.3 CMML患者外周血BTLA、HVEM表达水平较正常对照均明显降低(P<0.05)。4.体外MDS患者外周血γδ T细胞的增殖和功能研究4.1 MDS患者γδ T细胞体外培养扩增情况:经γδ T细胞唑来膦酸培养扩增体系培养了 12例患者外周血单个核细胞中有5例γδT细胞唑来膦酸刺激后能够有效扩增到80%,正常对照组均能扩增成功。(P=0.002)4.2 正常人与MDS患者体外扩增成功的γδ T细胞杀伤活性无明显区别(P>0.05)结论:MDS-RAEB和CMML患者与正常供者相比,外周血γδT细胞比例降低,提示其存在一定的免疫缺陷。CMML患者的外周血BTLA及其配体HVEM mRNA的表达与正常供者相比降低,且伴有外周血γδT细胞比例降低,提示BTLA/HVEM在调节γδT细胞的功能受损,同时CMML患者外周血γδT细胞在体外均不能成功扩增,而正常供者均能成功扩增,提示体外增殖功能下降。在体外成功扩增的MDS的γδT细胞的杀伤功能与正常对照组无明显差别