近些年来，人们在转基因植物方面进行了大量的研究。与微生物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统相比，转基因植物不需要昂贵的设备和严格的培养条件，具有光合自养、成本较低，植物病毒不感染人类等优点，已成为一类比较廉价和安全的生物反应器。然而高等植物培养周期过长，生长受季节性限制，因此许多研究兴趣集中到生长迅速，培养易的单细胞绿藻上。 杜氏盐藻属绿藻门绿藻纲团藻目，除缺乏细胞壁外，其形态和结构特征与衣藻十分相似，是一种原生质裸露的嗜盐性浮游单细胞藻，长约6-15μm，呈椭圆形或梨形，有双鞭毛，能在水中游动。有一个大型杯状叶绿体约占细胞体积的48％左右。该藻的突出优点在于抗逆性极佳，可在0.05M-5M的盐水中生长，最佳生长繁殖盐度为2-3M，是目前已知最耐盐的真核生物。由于杜氏盐藻可在高渗盐溶液中生长，这是许多其它生物难以生存的环境，故其大规模培养不需昂贵的发酵罐或其他培养装置，可以直接采用开放式培养，大大降低生产成本。因此，杜氏盐藻是生产药用蛋白的良好宿主。 植物的细胞核转化技术已发展成熟并得到广泛应用，但核基因组的遗传转化仍存在一系列至今尚未解决的问题：例如由于核基因组大，背景复杂，外源基因的整合位点和整合的拷贝数难以人为控制，造成郑州大学2003年博士学位论文杜氏盐藻(Dunaliella salina)叶绿体转化研究外源基因表达效率低，容易出现基因失活、基因沉默、位置效应等现象;同时转入多个基因时操作步骤过于复杂，所表达的原核基因必须经过修饰改造，环境安全难以保证等。 叶绿体转化系统的出现为克服这些困难带来了希望。与核转化相比，叶绿体基因组小，遗传操作简单，外源基因是通过同源重组机制定点整合进叶绿体基因组。定点整合有利于人为控制外源基因的插入位点，可以将目的基因定位在适于表达的位点，能较好地解决“顺式失活”、“位置效应”等类的基因沉默问题。由于叶绿体中DNA分子有多个拷贝，同时叶绿体对表达产物的积累有较强的承受能力，保障了外源基因在叶绿体中的高效表达。另外，由于叶绿体基因组的原核性质，对来自原核生物的外源基因无需改造就可以在叶绿体内高效表达，而且可以将多个外源基因采取“多顺反子”的原核表达形式同时引入，并由共同的启动子控制，既方便操作又可避免由于存在多个相同启动子所带来的“共沉默”。这是核基因转化无法做到的。 为建立杜氏盐藻叶绿体转化体系，我们研究了杜氏盐藻对7种基因工程研究中常用的抗生素及除草剂的敏感性;利用绿色荧光蛋白(E血anced盯een nuoreseent protein，EJP)为报告基因，验证了莱茵衣藻叶绿体atpA启动子在杜氏盐藻叶绿体中的生物活性，并构建载体转化盐藻，初步建立了杜氏盐藻叶绿体转化体系，为今后转基因盐藻生物反应器的建立和应用打下基础。 方法: 根据杜氏盐藻的近缘藻类的叶绿体基因组序列资料，在基因编码区的高度保守区域设计引物，克隆了杜氏盐藻叶绿体165识NA基因、咖L基因和ch】N基因，并分别以165识NA基因和chlN基因序列为同源片段，以CAT和bar基因为筛选标记基因构建了三套杜氏盐藻叶绿体转化载体: 2郑州大学2003年博士学位论文杜氏盐藻(D~Iiella salina)叶绿体转化研究pDS 165一eAf、pTN1269一bar和psp72一5一bar一3，用基因枪法转化杜氏盐藻，初步建立起杜氏盐藻叶绿体转化体系。 结果: 1.研究了杜氏盐藻对氯霉素、新霉素、链霉素、卡那霉素、G4 18、壮观霉素和除草剂草丁嶙(P hosphinotricin，PPT)等7种基因工程研究中常用的抗生素及除草剂的敏感性。实验结果表明，杜氏盐藻对卡那霉素、新霉素、G418和链霉素极不敏感，当这些抗生素用量高达600p创ml时，仍不能抑制杜氏盐藻的生长;壮观霉素对杜氏盐藻的生长有一定抑制作用，但用量较高，浓度为200、岁ml以上才能明显抑制杜氏盐藻的生长，并且即使用量高达600p留ml时仍不能完全杀死杜氏盐藻;杜氏盐藻对氯霉素敏感，50协留ml的氯霉素即可明显抑制杜氏盐藻的生长;100协留ml的氯霉素可杀死杜氏盐藻，200协留ml以上的氯霉素经10天左右即可杀死杜氏盐藻。此外，杜氏盐藻对除草剂草丁磷高度敏感，当培养液中草丁嶙浓度为1协留ml时，杜氏盐藻的生长就受到明显的抑制;草丁嶙浓度达到4协留ml时，培养3至5天即可明显观察到杜氏盐藻细胞的白化和死亡。 2.莱茵衣藻叶绿体吻A启动子在杜氏盐藻叶绿体中的生物活性 我们选取绿色荧光蛋白为报告基因，将报告基因插入殉A启动子与rbcL终止子之间，构建了质粒pSP71一atPA一EGFP，通过基因枪法转入杜氏盐藻，在荧光显微镜下观察到EGFP基因在杜氏盐藻叶绿体中得到了表达。 3.杜氏盐藻叶绿体165出NA基因的克隆和转化载体的构建 根据杜氏盐藻的近缘藻类的叶绿体基因组序列资料，克隆了杜氏盐藻叶绿体16SrRNA基因部分序列1100bp，并利用克隆的16SrRNA郑州大学2003年博士学位论文