第一章 叶酸代谢酶类的表达与生物功能对卵巢恶性肿瘤多药耐药影响的研究进展(综述)卵巢恶性肿瘤严重威胁妇女生命和健康,其发病率在妇科恶性肿瘤中居第三位,仅次于宫颈癌,宫体癌,而其死亡率居首位。卵巢癌发病隐匿,很多患者在出现症状之前已有腹腔转移,确诊时60%-70%患者已属于晚期。目前公认的最佳治疗方法以手术为主,辅以铂类和紫杉醇联合化疗f一线化疗),配合放疗、生物学治疗等,但至少有60%的患者最终出现获得性耐药,晚期患者五年生存率仅为30%-40%。卵巢癌多药耐药极大地影响了卵巢癌患者对化疗的敏感性,是限制其临床疗效的主要原因。卵巢癌耐药的产生过程是一个多因素、多基因、多途径、多步骤的复杂过程,目前对于卵巢癌多药耐药产生机制的研究主要集中在耐药相关基因及其表达产物的研究；耐药有关酶类的研究；其他与耐药相关物质的研究。近年来对卵巢癌多药耐药的研究也取得新的进展,如卵巢癌细胞单层培养向三维培养的转变：肿瘤微环境对耐药产生的影响；肿瘤转移对耐药的影响等。但卵巢癌多药耐药机制极为复杂,目前尚未完全研究明确,卵巢癌多药耐药进一步研究,在临床上预防耐药、控制耐药、逆转耐药,寻找高效低毒的新型药物,已成为目前急需解决的问题。叶酸的参与脱氧核糖核酸合成和细胞内甲基化反应,是体内重要甲基供体,可以通过干扰DNA甲基化与合成化参与肿瘤发生发展。叶酸不能被人体直接利用,需一系列叶酸代谢酶类将其分解活化后才能在人体发挥生物学功能。因此叶酸代谢酶类能保持基因组的稳定,影响体内DNA合成和修复,以及正常甲基化,叶酸代谢酶活性的变化可导致DNA合成修复异常、甲基化异常、基因组不稳定等,叶酸代谢酶基因多态性、叶酸缺乏或叶酸代谢障碍与肿瘤的形成关系密切。目前,叶酸代谢酶单核苷酸基因多态性在肿瘤的作用已是分子流行病学的研究热点之一。FOLR1、MTRR和DHFR等是叶酸代谢通路中重要的酶,其活性的变化影响叶酸的正常代谢、脱氧核苷酸三磷酸盐的生物合成以及DNA甲基化反应,进而在肿瘤的发生和发展扮演重要角色。FOLR1是具有高亲和力的叶酸受体,其位于细胞膜介导叶酸的胞吞途径,有研究表明,FOLR1上皮来源的恶性组织中表达明显增高,抑制FOLR1,细胞的化疗敏感性得到增加；MTRR能维持甲硫氨酸合成酶的活性,在MTR活化过程中发挥重要作用,影响Hcy代谢和DNA甲基化,有研究表明,MTRR A66G使其活性降低后,能导致心血管疾病、畸形儿以及肿瘤的发生；DHFR能降解叶酸,使其变为四氢叶酸(即活性叶酸),四氢叶酸也就是甲基供体,有研究表明,DHFR表达增高能增加细胞的耐药性。目前国内外有许多调查研究了叶酸代谢酶与肿瘤之间的关系,但研究成果之间仍存在不少争议。叶酸代谢酶作为一个极富前景的研究方向,其与卵巢癌发生发展、多药耐药之间的关系尚很不明确,值得我们进一步探索发现。第二章 FOLR1、MTRR和DHFR的表达对卵巢恶性肿瘤多药耐药中的临床意义目的：研究卵巢恶性肿瘤组织中叶酸结合蛋白(FOLR1)、甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)、二氢叶酸还原酶(DHFR)的表达及其临床意义。方法：采用Western Blot检测30例正常卵巢组织、50例卵巢良性肿瘤组织及80例卵巢恶性肿瘤组织中的FOLR1、MTRR蛋白表达情况；应用实时荧光定量PCR检测相同标本中DHFR基因的表达情况,分析其与恶性卵巢肿瘤间的临床病理及多药耐药的相关性。结果：(1) FOLR1、MTRR在正常卵巢组织,卵巢良性肿瘤和卵巢恶性肿瘤中的表达量依次增高(P<0.05)；DHFR在正常卵巢组织,卵巢良性肿瘤和卵巢恶性肿瘤中的表达量依次降低(P<0.05)。(2) FOLR1、MTRR在卵巢恶性肿瘤FIGO临床分期中Ⅰ-Ⅱ期的表达量低于Ⅲ-Ⅳ期,在组织分级高分化中的表达量低于中低分化(P<0.05)：DHFR在FIGO |临床分期和组织分级表达差异无统计学意义(P>0.05)。(3) FOLR1在铂类药物耐药型卵巢恶性肿瘤中的表达量低于铂类药物敏感型(P<0.05)；MTRR、DHFR在铂类药物耐药型卵巢恶性肿瘤中的表达量高于铂类药物敏感型(P<0.05)；FOLR1在治疗后仍进展肿瘤中的表达量低于缓解者(P<0.05)；MTRR、DHFR在治疗后仍进展肿瘤中的表达量高于缓解者(P<0.05)。(4) FOLRl在粘液性肿瘤中的表达量低于浆液性肿瘤(P<0.05),在有淋巴结和远处器官转移的卵巢恶性肿瘤中高于未有转移者(P<0.05),与患者的不同肿瘤病理分类、是否有大网膜转移和腹水量多少无明显相关(P>0.05)；MTRR在浆液性肿瘤中的表达量高于粘液性肿瘤(P<0.05),在有远处器官转移的卵巢恶性肿瘤中高于未转移者(P<0.05),与患者是否淋巴结转移、是否有大网膜转移和腹水量无明显相关(P>0.05)；DHFR在浆液性肿瘤中的表达量高于粘液性肿瘤和内膜样肿瘤(P<0.05),在有大网膜转移的卵巢恶性肿瘤中低于未转移者(P<0.05),与患者是否淋巴结转移、是否有远处转移和腹水量无明显相关(P>0.05)。 (5)取FOLR1表达量界值为3.115时来判断卵巢肿瘤性质,ROC曲线的Youden指数最大,卵巢恶性肿瘤FOLR1表达量的高低与中位生存时间差别无明显相关(P>0.05),COX模型多因素分析显示FOLR1表达量不是影响患者生存预后的独立因素；取MTRR表达量界值为0.618时来判断卵巢肿瘤性质,ROC曲线的Youden指数最大,卵巢恶性肿瘤MTRR表达量的高低与中位生存时间差别无明显相关(P>0.05), COX模型多因素分析显示MTRR表达量不是影响患者生存预后的独立因素；取DHFR表达量界值为0.331时来判断卵巢肿瘤性质,ROC曲线的Youden指数最大,卵巢恶性肿瘤DHFR表达量的高低与中位生存时间差别有相关性(P<0.05),COX模型多因素分析显示DHFR表达量是影响患者生存预后的独立因素。结论：FOLR1在卵巢恶性肿瘤组织中的表达量高于正常卵巢和卵巢良性肿瘤,在铂类药物敏感型卵巢恶性肿瘤中FOLR1表达高于铂类药物耐药型卵巢恶性肿瘤,提示FOLR1与卵巢恶性肿瘤多药耐药相关；MTRR在恶性卵巢肿瘤组织中的表达量高于正常卵巢和良性卵巢肿瘤,MTRR在铂类药物耐药型卵巢恶性肿瘤中表达高于铂类药物敏感型；DHFR在卵巢恶性肿瘤中表达低于正常卵巢和卵巢良性肿瘤,DHFR在铂类药物耐药型卵巢恶性肿瘤中呈高表达,敏感型卵巢恶性肿瘤中低表达。提示三种酶可作为新型诊断标志物有助于早期检测卵巢恶性肿瘤,且其与恶性卵巢肿瘤铂类耐药关系密切新,对于判断及预测恶性卵巢肿瘤多药耐药的发生发展有重要意义。第三章MTRR基因对卵巢上皮性癌SKOV3耐顺铂细胞的体内外生物功能研究目的：构建下调甲硫氨酸和酶还原酶(MTRR)的慢病毒载体并进行鉴定。研究卵巢癌SKOV3/DDP细胞中MTRR基因表达下调后对其生物学功能的影响以及作用途径。方法：筛选干扰效果最好的shRNA,链接至pSicoR载体质粒,重组阳性克隆进行测序鉴定,重组质粒与其辅助质粒共同转染293T细胞包装病毒,病毒颗粒感染SKOV3/DDP细胞,流式分选,RT-PCR和Western Blot检测MTRR的表达。MTT法测定三组细胞(SKOV3/DDP、shNC-SKOV3/DDP、shMTRR-SKOV3/DDP)的生长增值情况、顺铂对三组细胞的IC50和不同顺铂浓度分别作用不同时间三组细胞的生长曲线、克隆形成；流式细胞术检测不同顺铂浓度作用48小后时对三组细胞周期分布的影响。结果：成功构建了MTRR慢病毒干扰载体,能高效感染SKOV3/DDP细胞,转然后MTRR基因稳定下调。实验组细胞(shMTRR-SKOV3/DDP)与两组对照组相比较：(1)顺铂对其作用的IC50值降低、增殖速度明显降低。(2)顺铂对其生长抑制率增加(P<0.05),MTRR干扰后SKOV3/DDP对顺铂的敏感性增加。(3)顺铂诱导后细胞阻滞于G0/G1期,其比例明显增加(P’<0.05)。结论：MTRR基因下调后能降低卵巢癌SKOV3/DDP细胞的增殖能力；SKOV3/DDP细胞中MTRR基因下调后细胞对顺铂的敏感性增加；MTRR基因下调后顺铂将其细胞阻滞在G0/G1期。第四章MTRR基因对卵巢上皮性癌SKOV3细胞多药耐药中的自噬和凋亡的影响及机制研究目的：探索MTRR基因下调后在顺铂耐药的卵巢癌SKOV3细胞中凋亡和自噬的变化,以及对凋亡Caspase和Bcl-2家族以及PI3K-AKT1自噬通路的影响,为MTRR逆转卵巢癌耐药提供可能的途径,为临床使用提供有利数据。方法：流式细胞术检测不同顺铂浓度分别作用48小时诱导三组细胞的凋亡率；激光共聚焦检测不同顺铂浓度作用48小后时对三组细胞LC3B分布的影响；Western Blot检测一定顺铂浓度作用48小后时对三组细胞LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、p62的影响；雷帕霉素在实验组细胞中诱导自噬,检测顺铂作用后生存率和凋亡率改变；透射电镜观察三组细胞自噬体。一定浓度的顺铂(4μg/ml)对三组细胞(SKOV3/DDP、shNC-SKOV3/DDP、 shMTRR-SKOV3/DDP)进行不同时间诱导,并用使用免疫蛋白印迹(Western blot)方法检测caspase和Bcl-2家族以及PI3K-AKT1自噬通路关键蛋白的表达和变化,得到蛋白表达发生变化的作用时间。再用一定浓度的顺铂对三组细胞作用一定时间,Western blot检测关键蛋白,得出三组细胞问蛋白表达差异。结果：顺铂诱导后,激光共聚焦显微镜下观察细胞LC3B-Ⅱ,聚集减少；顺铂诱导后,Western Blot显示细胞LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值降低,p62升高；雷帕霉素诱导实验组细胞后,.细胞在顺铂中的生存率升高,凋亡率降低；透射电镜未见自噬体形成。三组细胞顺铂4μg/ml诱导三组细胞48小时后,实验组细胞(shMTRR-SKOV3/DDP)与两组对照组相比较：(1)凋亡通路上Bax, cleaved caspase-9, cleaved caspase-3以及cleaved PARP显著升高(P<0.05),Bcl-2显著降低(P<0.05)。(2)自噬通路上p-AKT1和p-mTOR显著上调(P<0.05),而AKT1和mTOR无显著变化。结论：在顺铂诱导下凋亡增加；MTRR基因下调能在SKOV3/DDP细胞中减弱顺铂诱导产生的自噬。MTRR下调通过影响激活caspase和Bcl-2凋亡家族以及抑制PI3K-AKT1自噬通路可增加顺铂耐药细胞的敏感性,也我们进一步研究卵巢癌耐药发展过程中的信号转导通路机制研究及其在临床中的应用提供了重要的指导意义。