背景和目的宫颈癌是发展中国家成年女性的常见和重要的公共卫生问题。高危型人乳头瘤病毒(HPV16和HPV18)是宫颈癌最重要的危险因素。组织学被认为是诊断宫颈癌发展的病理进展的金标准,准确的阴道镜检查和宫颈前体病变的组织学评估对于确定临床管理至关重要。由于宫颈上皮内瘤变2级(CIN2)的高转化率,尚不清楚哪种病变最终会发展为浸润性癌症,CIN2管理在诊治之间存在差异。由于病理学家的诊断主观性较强,单独使用H&E染色具有局限性,无法肉眼判断宫颈病变的程度,对于这部分组织的临床病理判定,通常选用基于免疫组织化学染色(IHC)或生物标记物的分类系统,可以提高CIN分级的准确性和可重复性,从而使诊断更为标准化。细胞增殖核抗原Ki-67和多肿瘤抑制基因p16被广泛用于指导病理学家对CIN进行分级。然而,标记物p16及Ki-67的特异性较低,不足以协助给出明确的病理诊断。病因学研究提示高危型HPV E6蛋白和上皮转化相关,其在病毒由一过性感染发展为持续性感染过程中起重要作用,而持续性感染是宫颈癌前病变和癌症发生的必要因素,能够将有转化潜力的持续性感染从一过性感染区分出来使得高危型HPV E6蛋白的检测极具有意义。然而,使用HPV16/18 E6为CIN2分流的参考指标需要进一步的对比分析其在宫颈病变组织中的表达特点。本研究以CIN2+作为疾病终点来阐明CIN的阶段,使用抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶方法,在福尔马林固定的石蜡包埋的宫颈组织切片上进行HPV16/18 E6和p16、Ki-67的免疫组织化学分析,观察三者在宫颈病变的过程中的表达特征,探究三者对CIN2的临床分流价值。资料与方法1.一般资料本项回顾性研究选用了2016年9月1日至2018年8月31日期间于郑州大学第二附属医院行宫颈脱落细胞HPV-DNA分型检测提示HPV16型和(或)HPV18型阳性的患者(无其他型别HPV感染),且进一步于阴道镜下取宫颈病理活检提示宫颈炎、宫颈上皮内瘤变或宫颈鳞状细胞癌的患者190例,具有以下标准的患者被排除在研究之外:(i)年龄<20岁;(ii)HPV16/18检测结果为阴性;(iii)无宫颈组织病理学诊断;(iv)进行子宫或宫颈切除术;(v)病例资料不完整。本研究已通过郑州大学第二附属医院伦理委员会审查。2.实验方法取所有宫颈病变组织蜡块连续切片,并按照切割顺序分配到带电荷的载玻片上。第一部分和最后一部分用苏木精和伊红(H&E)染色以确保中间所取病理标本为相同级别的宫颈病变组织,中间部分用抗HPV16/18 E6抗体和针对Ki-67抗原(DAKO,克隆MIB-1)、p16抗原的小鼠单克隆抗体进行免疫组织化学染色,并通过PCR检测组织中高危型HPV-DNA以明确组织中感染的HPV病毒型别。分别进行以下研究:(1)H&E染色;(2)PCR;(3)HPV16/18 E6、p16、Ki-67 IHC;(4)HPV DNA ISH;(5)阴性对照;(6)H&E染色。染色结果判读标准:HPV E6、p16 IHC阳性结果判读:以棕色胞核染色或胞浆染色为阳性,反之为阴性。根据文献,按阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱评分(immunohistochemical scores,IHS):IHS=a×b。a代表阳性细胞百分比:a=0,无阳性细胞;a=1,阳性细胞为1%~10%;a=2,阳性细胞为11%~50%;a=3,阳性细胞为51%~80%;a=4,阳性细胞为81%以上。b代表阳性细胞染色强弱:b=0,阴性;b=1,弱阳性;b=2,中度阳性;b=3,强阳性。IHS 0分为(-);IHS 1~4分为(+);IHS 5~8分为(++);IHS 9~12分为(+++)。每张切片均以IHS评价得分情况。Ki-67 IHC阳性结果判读:以细胞核内出现棕褐色颗粒为阳性。分为4组:0(所有细胞阴性),+(6-25%细胞中阳性染色),++(26-50%细胞中阳性染色)或+++(阳性染色超过50%的细胞)。HPV-DNA原位杂交结果判读:以细胞核出现棕褐色颗粒为阳性。结果1.PCR法检测宫颈病变组织中感染的HPV型别均为16和(或)18型感染,与宫颈脱落细胞中感染的HPV型别相同。2.HPV16/18 E6、p16、Ki-67在宫颈病变组织中的表达特点:2.1 E6蛋白在宫颈炎组织和CIN1中表达定位于鳞状上皮细胞的胞核及胞浆中,主要呈弱阳性(+)表达,阳性率分别为4.5%和13.6%;随着病变进展,E6蛋白的阳性率和表达强度明显增加,CIN2的阳性率为53.0%,以中阳性(++)表达为主;CIN3的阳性率达72.0%,主要呈现中强阳性(++~+++)表达;宫颈癌组织中的阳性率为86.7%,以强阳性(+++)表达为主。五组宫颈病变组织中HPV16/18 E6蛋白的阳性率差异具有统计学意义(P<0.001)。成对比较结果提示,宫颈炎组织和CIN1中E6蛋白阳性率明显低于CIN2、CIN3及宫颈癌组织(P<0.05)。CIN2与CIN3的E6蛋白阳性率无明显统计学差异(P>0.05)。2.2 p16在宫颈炎组织和CIN1的表达定位于鳞状上皮基底层细胞胞浆中,表达较弱,随着病变的进展向表层推进,CIN3的上皮全层呈现强阳性表达,宫颈癌组织中癌细胞基本全部呈现p16阳性着色。宫颈炎的阳性率为4.55%;CIN1的阳性率为40.9%;CIN2的阳性率71.2%,以中阳性为主,向强阳性过渡;CIN3中p16在胞浆及胞核中表达最强,阳性率为92.0%,主要呈现中强阳性表达;宫颈癌的阳性率达到100.0%。五组宫颈病变组织中p16阳性率差异具有统计学意义(P<0.001)。成对比较结果提示,宫颈炎的p16阳性率明显低于CIN和宫颈癌(P<0.05)。2.3 Ki-67在CIN1中表达定位于基底层和副基底层细胞核中,呈颗粒状分布;随着病变的进展逐渐向表层推进,CIN3及宫颈癌的上皮全层胞核中呈现强阳性表达。宫颈炎的阳性率为9.1%;CIN1的阳性率为90.9%,以弱阳性为主;CIN2、CIN3及宫颈癌的阳性率均为100%,主要呈现强阳性表达。五组宫颈病变组织中Ki-67阳性率差异具有统计学意义(P<0.001)。成对比较结果提示,宫颈炎组织中Ki-67阳性率明显低于CIN和宫颈癌(P<0.05)。3.HPV16/18 E6与p16、Ki-67表达强度的相关性分析:CIN1的E6与p16表达强度的相关性无统计学意义(P>0.05);在CIN2中随着表达强度的增加,E6与p16相关性逐渐增强,强阳性表达时相关系数最大,为0.489(P<0.05);CIN3的E6与p16的表达相关系数在中阳性表达和强阳性表达时均小于CIN2,分别为0.342、0.327(P<0.05)。E6与p16在CIN2中表达强度的相关性最强,以强阳性表达最为显著。宫颈病变中Ki-67和E6的表达强度无相关性。4.E6、p16、Ki-67对CIN1及CIN2/3诊断的敏感性与特异性:E6蛋白呈阳性(1+~3+)表达时,诊断宫颈高级别病变(CIN2+)的敏感性为0.2969,特异性为0.9595,似然比为7.323,有显著的统计学意义(P<0.0001)。p16呈阳性(1+~3+)表达时,诊断宫颈高级别病变(CIN2+)的敏感性为0.3611,特异性为0.9118,似然比为4.093(P=0.003);p16呈中强阳性(2+~3+)表达时,敏感性为0.2537,特异性为0.9231,似然比为3.299(P=0.005);p16呈强阳性(3+)表达时,诊断宫颈高级别病变(CIN2+)无统计学意义(P=0.4077)。Ki-67呈中强阳性(2+~3+)表达时,诊断宫颈高级别病变(CIN2+)的敏感性为0.7907,特异性为0.9145,似然比为9.251,有统计学意义(P<0.0001)。5.HPV16/18 E6蛋白在宫颈病变组织的真皮层中淋巴细胞的表达:宫颈病变组织的相邻正常组织中的淋巴细胞中有HPV16/18 E6蛋白的表达。这一结果似乎提示HPV16/18存在通过血液循环传播到其他器官的可能。6.HPV-DNA在宫颈病变组织中的分布情况:原位杂交方法检测宫颈病变组织中的HPV-DNA显示其主要分布在宫颈上皮组织的表层挖空细胞中,并未在基底层及副基底层检测到HPV-DNA。结论1.HPV16/18 E6、p16和Ki-67的表达均与宫颈病变的程度相关,随着病变的进展,三者的表达量均逐渐增加。2.E6与p16表达强度的相关性在CIN2中最强,以强阳性表达最为显著,提示两者可能存在某些内在关联。3.与p16、Ki-67相比,HPV16/18 E6诊断宫颈高级别病变(CIN2+)敏感性较低,特异性较高,在临床诊断宫颈高级别病变时可考虑联合HPV E6、p16、Ki-67三个指标以提高诊断效能。