研究背景软骨肉瘤是软骨来源的恶性骨肿瘤,其发病率仅次于骨肉瘤而位于原发性恶性骨肿瘤的第二位。手术虽是软骨肉瘤首选和有效的治疗手段,但要求肿瘤彻底切除,否则极易复发。由于软骨肉瘤对化疗的敏感性欠佳,因此化疗在临床上的应用受到了极大的限制。如何提高软骨肉瘤对化学治疗的敏感性,一直是软骨肉瘤治疗领域的一个核心问题。微小RNA (microRNA, miRNA)是由19-25个核苷酸组成的小单链非编码RNA,广泛表达于高等真核生物基因组中。每一种miRNA都具有物种特异性。到目前为止,已发现一百多种miRNA在细胞的增殖、分化、迁移以及细胞周期、凋亡等生物过程中发挥重要作用。随着研究的不断深入,miRNA在肿瘤的发生、发展、治疗等各个环节所起的重要作用已为大家公认。1miRNA通过与mRNA结合对机体进行调控,相同miRNA在不同组织中与不同的靶基因结合发挥不同的调节作用,都显示了miRNA的调节机制是一个复杂的网络结构。正常情况下,miRNA通过精准的网络调节维持机体各细胞、组织中蛋白水平维持平衡,然而当其功能缺失或获得,将打破原有平衡。有研究表明niRNA作为一种潜在的抑癌/促癌因子,在许多人类肿瘤组织中miRNA表达异常,因此在肿瘤的诊断、治疗和预后中具有重要意义。随着对miRNA与肿瘤发生发展相关性研究的不断深入,越来越多的证据表明miRNA参与了调控肿瘤细胞对化疗的敏感性,这对揭示肿瘤的耐药机制有着重要意义。肿瘤化疗耐药是肿瘤患者预后差的主要原因之一。miRNA突变、异常表达或异常加工均会导致miRNA功能异常,并导致其靶蛋白表达异常。若靶蛋白与肿瘤细胞对药物敏感性相关,则相关miRNA的异常将会导致肿瘤细胞对药物敏感性的改变。miRNA参与化疗耐药的机制一般可分为：与凋亡相关的miRNA介导的化疗耐药,与药物转运相关miRNA介导的化疗耐药,与细胞修复相关miRNA介导的化疗耐药,以及与药物作用靶点相关miRNA介导的化疗耐药等。目前,miRNA在肿瘤耐药中的研究刚刚起步,目前研究大多是通过对比耐药细胞株与亲本敏感细胞株之间miRNA表达谱异常,寻找与药物敏感性相关的关键miRNA,从而进一步对肿瘤细胞化疗耐受机制进行深入研究和寻找新的药物作用靶点。顺铂是抗实体肿瘤的一线用药,为铂的金属络合物,其作用类似于烷化剂,干扰DNA复制,为周期非特异性抗肿瘤药物,具有抗癌谱广、作用强、与多种抗肿瘤药有协同作用且无交叉耐药等特点,是目前联合化疗最常使用的药物之一。本研究分为两个部分,以顺铂为例分别探讨microRNA-100 (miR-100)与microRNA-23b (miR-23b)恢复软骨肉瘤细胞对顺铂敏感性的机制,为miRNAs成为软骨肉瘤的治疗策略提供理论基础。第一部分：miR-100恢复软骨肉瘤细胞对顺铂敏感性的实验研究[研究目的]探讨miR-100增加软骨肉瘤细胞对顺铂敏感性的机制,为软骨肉瘤基于miR-100的化疗策略提供了理论基础。[方法]1.采用实时定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测miR-100在多种人软骨肉瘤细胞系、正常软骨细胞系以及患者软骨肉瘤组织标本中的表达水平。2.采用浓度梯度法对软骨肉瘤CH-2879细胞系进行药物筛选,获得对顺铂耐受的CH-2879细胞(命名为：CH-2879/DDP细胞),qRT-PCR检测并比较CH-2879细胞及CH-2879/DDP细胞的miR-100表达水平：MTT及克隆形成实验检测比较两种细胞在顺铂作用下的增殖能力和克隆形成能力。3. miRNA数据库(TargetScan, Pictar, and MicroRNA)预测miR-100的作用靶点。4.采用脂质体2000法将pre-miR-100和anti-miR-100以及它们的阴性对照分别转入CH-2879细胞,qRT-PCR验证转染后细胞miR-100的表达水平,蛋白质印迹法(western blot)检测提高或抑制miR-100后mTOR的表达水平以及]mTOR下游蛋白S6K和4EBP1的磷酸化水平。5.荧光素酶报告基因法(Luciferase reporter assay)进一步验证miR-100作用于mTOR的3’端非翻译区(3’untranslated region, UTR)。6.将CDDP. BEZ235以及CDDP+BEZ235分别处理CH-2879/DDP细胞及CH-2879细胞,观察抑制mTOR通路,软骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性。7.将miR-100及其对照分别转染CH-2879细胞及CH-2879/DDP细胞,观察miR-100高表达与软骨肉瘤细胞对顺铂敏感性的关系。8.外源性S6K过表达质粒转染事先已经转染过miR-100的软骨肉瘤细胞,观察mTOR通路活性恢复后,软骨肉瘤细胞对顺铂耐受性的变化。[结果]1.miR-100在人软骨肉瘤细胞和患者软骨肉瘤标本中的表达下调。2. CH-2879/DDP细胞中miR-100表达下调,提示该基因与软骨肉瘤化疗耐受有关。3. mTOR及其所在信号通路是目前肿瘤病理机制研究的热点,正如我们预测的一样,mTOR是miR-100的直接靶点之一。miR-100的过／低表达能抑制／恢复mTOR的表达水平。4.miR-100的高表达增加软骨肉瘤对顺铂的敏感性,进一步印证了该基因与软骨肉瘤化疗耐受有关。5. mTOR通路活性的恢复使miR-100过表达的软骨肉瘤细胞表现出对顺铂的耐受,提示miR-100的过表达增加软骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性是通过对mTOR通路的抑制实现的。[结论]与正常软骨细胞相比,miR-100在软骨肉瘤细胞及软骨肉瘤患者标本中的表达均下调,提示miR-100是软骨肉瘤的抑制基因；与原代软骨肉瘤细胞相比,miR-100在CH-2879/DDP细胞中表达下调,这不仅说明miR-100具有肿瘤抑制功能,而且与软骨肉瘤对顺铂的化疗敏感性有关。nTOR在多种恶性肿瘤中活化,可以成为治疗癌症的一个有前景的治疗靶点。在本研究中,我们确定了mTOR是miR-100直接靶目标,并首次报道了miR-100过表达通过抑制mTOR通路增加软骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性,为软骨肉瘤基于miR-100的治疗策略提供了理论基础。第二部分：miR-23b恢复软骨肉瘤细胞对顺铂敏感性的实验研究[研究目的]探讨miR-23b增加软骨肉瘤细胞对顺铂敏感性的机制,为软骨肉瘤基于miR-23b的化疗策略提供了理论基础。[方法]1.采用qRT-PCR检测miR-23b在多种人软骨肉瘤细胞系、正常软骨细胞系以及患者软骨肉瘤组织标本中的表达水平。2.采用脂质体2000法将pre-miRs和control-miRs转染SW1353细胞；并在转染后不同时间点检测细胞的增殖情况。3.在常规细胞培养条件下,CH-2879细胞与CH-2879/DDP细胞分别接受顺铂刺激48小时,利用显微镜观察细胞形态的改变以及利用qRT-PCR检测miR-23b的表达。4.根据以往报道我们预测并验证Src是miR-23b的直接靶目标。5.通过采用不同浓度的顺铂分别作用于CH-2879细胞,48小时后收集细胞行western blot分析,验证miR-23b过表达抑制Src-Akt通路的作用。6.采用脂质体2000法将pre-miR-negative或pre-miR-23b分别转入CH-2879细胞,qRT-PCR验证转染后细胞1miR-23b的表达水平,western blot检测提高或抑制miR-23b后总的Src和磷酸化Src的水平。7.采用脂质体2000法,将含有野生型(wt)和突变型(mut) Src 3’UTR转染细胞,转染后利用荧光素酶报告基因法进一步验证miR-23b作用于Src3’UTR区。8.以contral-miR或pre-miR-23b分别转染CH-2879细胞、SW1353细胞和CH-2879/DDP细胞,用不同浓度的顺铂处理细胞后MTT法测定细胞活性。9.将：niR-23b转染CH-2879细胞及CH-2879/DDP细胞,观察miR-23b过表达恢复软骨肉瘤细胞对顺铂敏感性的作用。10.外源性Src过表达质粒转染事先已经转染过niR-23b的软骨肉瘤细胞,观察Src-Akt通路活性恢复后,软骨肉瘤细胞对顺铂耐受性的变化。[结果]1. miR-23b在多种软骨肉瘤细胞系及软骨肉瘤患者标本组织中的表达下调。2. CH-2879/DDP细胞中miR-23b表达下调,提示该基因也与软骨肉瘤对顺铂的化疗耐受有关。3.Src激酶参与了多种肿瘤的增殖、迁移和入侵,CH-2879/DDP细胞的Src-Akt通路活性的上调4.软骨肉瘤细胞中Src是miR-23b的直接靶目标5. miR-23b的过度表达通过直接抑制Src-Akt通路恢复了软骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性。6.Src-Akt通路活性的恢复增加了miR-23b过表达软骨肉瘤细胞对顺铂的耐药性。[结论]同miR-100一样,miR-23b在软骨肉瘤细胞中的表达下调,提示它是一种肿瘤抑制基因,与软骨肉瘤对顺铂的化疗敏感性有关。我们经实验确认,Src是miR-23b的一个直接靶向目标,Akt是一种用于调节新陈代谢、细胞周期进展和细胞存活率的细胞质丝氨酸和苏氨酸激酶,miR-23b可以通过对Src-Akt通路的负向调节提高软骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性,为软骨肉瘤基于miR-23b的治疗策略提供了理论依据。