目的:本实验对人子宫内膜、蜕膜以及月经血三种不同组织进行子宫内膜干/祖细胞的体外分离、培养和克隆,以观察三种不同组织来源的干细胞间是否有差异。同时用平板集落形成实验和96孔板有限稀释法两种不同的方法对月经血间充质干细胞(Mesenchyma stem cells,MSCs)进行单克隆培养,以观察两种方法获得的单克隆是否有差异。方法:1.利用免疫组织化学和免疫荧光化学方法鉴定人子宫内膜MSCs在体内的定位。2.利用胶原酶消化、不同孔径滤网过滤以及差速贴壁相结合的方法,体外分离和培养人子宫内膜和蜕膜干/祖细胞。3.利用人外周血淋巴细胞分离液水平离心的方法从人月经血中分离和培养出月经血MSCs。4.利用不同浓度人纤维连接蛋白包被96孔板,以测定人纤维连接蛋白对人月经血MSCs粘附和增殖的影响,从而确定包被的最佳浓度。5.利用平板集落形成实验和96孔板有限稀释法两种不同方法对人月经血MSCs进行单克隆培养。6.利用免疫细胞化学和免疫荧光化学的方法鉴定体外培养的人子宫内膜和蜕膜干/祖细胞以及月经血MSCs的表面标记物。7.对不同干细胞表型的人月经血MSCs单克隆进行成脂和成骨分化培养。结果:1.人子宫内膜MSCs表面标记物在体内主要表达在基底层,如CD140β和CD146抗体,且CD146和CD140β共定位在细胞外基质内血管周围,尤其是基底层的血管周围;CD90主要表达在功能层;而SUSD2的表达在功能层和基底层无明显差异。2.体外分离和培养的人子宫内膜和蜕膜MSCs,在细胞形态上有差异,原代蜕膜MSCs有蜕膜化表现,经过三次传代后,其形态和子宫内膜MSCs基本一致,且两种MSCs均可传30代以上,生长超过6个月;两种MSCs原代和传代细胞的克隆能力基本相同;子宫内膜和蜕膜均可成功分离和培养出上皮祖细胞,但本实验未能成功传代。3.利用人外周血淋巴细胞分离液能成功分离和培养出人月经血MSCs,且同样可以传30代以上,生长超过6个月,月经血的分离过程和子宫内膜和蜕膜组织的相比操作更简单。从人子宫内膜、蜕膜以及月经血MSCs P3的生长曲线可以看出,月经血MSCs中可能存在增殖能力更强的干细胞。4.通过不同浓度人纤维连接蛋白对月经血MSCs粘附和增殖的影响,确定了人月经血MSCs包被人纤维连接蛋白的最佳浓度为10μg/m L。5.平板集落形成实验和改良的96孔板有限稀释法均可成功单克隆出人月经血MSCs,其中改良的96孔板有限稀释法操作更简单,克隆率更高。6.所有人月经血MSCs单克隆培养获得的大小克隆均表达CD140β、CD90以及SUSD2,部分大克隆表达CD146,且CD146阳性的大克隆其自我更新以及增殖传代能力更强。7.人月经血MSCs单克隆中CD146和CD140β双阳性大克隆其成脂和成骨分化能力更强。结论:1.从人子宫内膜、蜕膜以及月经血中均成功分离和培养出了MSCs,其中月经血分离过程最简单。2.在人月经血MSCs单克隆培养过程中包被人纤维连接蛋白能促进细胞的粘附和增殖,从而提高单克隆效率。3.利用改良的96孔板有限稀释法对人月经血MSCs进行单克隆培养,操作更简单且克隆率更高。4.CD146和CD140β双阳性的人月经血MSCs具有更高的自我更新、增殖传代以及成脂和成骨分化能力。