胃癌(Gastric cancer,GC)是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一,其发病是一个多因素、多步骤、多基因参与的复杂病理过程。已经知道,抑癌基因CDH1胚系突变构成部分家族性胃癌的遗传学基础,而散发性胃癌的肿瘤细胞中CDH1基因编码蛋白E-cadherin的表达多明显下调或缺如。人类错配修复基因hMLH1胚系突变是遗传性非息肉性结直肠癌的重要病因,而在胃癌高发的东亚人群,部分家族性胃癌的发病亦与hMLH1基因功能异常相关。本课题组前期在胃癌遗传与表观遗传学的研究中做了大量工作。在中国人胃癌患者中检出多种CDHI及hMLH1基因新的胚系突变,并深入分析了基因多种体细胞的甲基化状态。然而,在部分胃癌患者,我们未发现CDH1及hMLH1基因胚系或体细胞的病理性突变,也未检出基因启动子区高度甲基化变异,但检测靶基因在胃癌组织中表达缺如,其调控机制不清。pre-mRNA选择性剪接是真核生物基因转录后表达调控的关键环节之一,构成蛋白质多样性的一个主要来源,也是生物细胞功能平衡系统调控的重要组成部分。选择性剪接产物的自然平衡维持细胞的正常功能,剪接过程的异常可导致这种功能平衡的破坏,细胞某些关键基因的功能性蛋白表达模式改变,与肿瘤等多种人类疾病的发病风险增高相关联。最近研究揭示,除传统RNA序列元件及其相关剪接因子之外,DNA甲基化及组蛋白修饰等表观遗传修饰也可对pre-mRNA剪接发挥重要作用。鉴于此,我们在课题组前期胃癌患者基因突变分析工作的基础上,深入探讨胃癌发病相关的重要抑癌基因CDH1及hMLH1 pre-mRNA选择性剪接调控机制,涉及DNA结构、RNA序列元件及基因的表观遗传修饰作用等,以期为胃癌的发生及演变基因学基础研究提供新的思路。本研究由两部分组成:第一部分:CDH1基因突变及表观修饰异常与胃癌细胞CDH1 pre-mRNA选择性剪接的关系研究我们在282例胃癌患者和425例正常对照外周血细胞DNA样本中筛查CDH1基因胚系突变,并分析胃癌组织及其同源正常组织cDNA样本中CDH1 pre-mRNA选择性剪接状态,深入探讨遗传结构变异与表观修饰异常对CDH1 pre-mRNA选择性剪接的可能影响。结果如下:1.我们在胃癌患者中首报CDH1外显子9(Exon 9)的胚系突变c.1296C>G(N432K)和c.1297G>A(D433N),而在后续425例正常对照中未检出这两种突变。我们采用RT-PCR技术分析携带突变患者胃组织细胞cDNA,并切胶测序确定,CDH1c.1296C>G影响其pre-mRNA剪接而导致CDH1 Exon 9的跳跃,应为病理性突变;而CDH1 c.1297G>A未影响其mRNA表达产物的长度。2.RT-PCR分析还提示,胃癌患者CDH1基因Exon 8近下游剪切位点还存在缺失83bp(CDH1 1054del83)的异常剪接产物。这种异常剪接的mRNA产物,与正常转录剪接的mRNA共同存在。我们进而针对50例胃癌患者的组织样本cDNA,Taqman探针实时定量PCR技术分析CDH1该区域剪接状态。结果显示,超过一半的患者检出CDH1 1054del83异常剪接,提示这种选择性剪接是一种普遍现象,并在多株体外培养胃癌及胃组织细胞的检测中得到验证,且该异常剪接产物的量在癌细胞中显著增加。3.我们前期的突变筛查并未发现CDH1 Exon 8及附近内含子(Intron)序列的结构变异,寻找CDH1 Exon 8选择性剪接的其它影响因素引起我们的兴趣。多方面的证据显示,基因转录与剪接可能同时进行并紧密耦联。因此,pre-mRNA选择性剪接的调节可能受到基因表观遗传修饰的影响。我们首先检测了 CDH1基因Exon 7-9 DNA序列的甲基化状态,分析其与Exon 8选择性剪接的关系。结果表明,胃粘膜细胞与三种胃癌细胞中CDH1 Exon 8及其周围序列均存在DNA高甲基化。采用DNA甲基化转移酶抑制剂AZA处理并未影响CDH1 1054del83异常剪接产物的丰度。提示,分析序列的DNA甲基化不构成CDH1选择性剪接的影响因素。4.染色质免疫共沉淀结果显示,胃癌细胞株SGC-7901及BGC-823中,CDH1 Exon 8及其周边序列H3ac及H4K16ac水平均显著低于人胃粘膜细胞株GES-1。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)TSA处理后,SGC-7901与BGC-823中,CDH1 1054del83异常剪接产物相对全长野生型mRNA产物量的比值均显著降低。提示HDACi处理后,伴随着转录的激活及RNA聚合酶II(RNA polymerase II,RNAP II)延伸速度加快,存在着剪接模式的定量改变。5.组蛋白甲基化的差异发生于特定赖氨酸位点,体外培养胃癌细胞株与人胃粘膜细胞株比较,H3K4me2未见差异,而H3K36me3在CDH1 Exon 8及其周边区域富集。细胞中加入siSETD2(H3K36me3特异的甲基化转移酶SETD2的干扰RNA)后,CDH1 1054del83异常剪接产物量相对全长野生型mRNA产物量的比值显著降低。而提高H3K36me3水平则可能促进CDH1 1054del83异常剪接的产生。然而,针对siSRSF2干扰后,几种细胞中CDH1 1054del83剪接子相对野生型mRNA转录产物的比值均未见差异,提示CDH1 1054del83选择性剪接不受SRSF2剪接因子途径的调控。第二部分:胃癌细胞中hMLH1基因pre-mRNA选择性剪接的遗传学与表观遗传学基础在236例胃癌外周血样本和240例正常对照DNA中,我们筛查hMLH1基因胚系突变,并分析胃癌组织及同源正常组织样本cDNA中hMLH1 pre-mRNA选择性剪接状态,进一步探讨hMLH1基因pre-mRNA选择性剪接的遗传学与表观遗传学基础。结果显示:1.针对本实验室首报的中国人特有的错配修复基因的hMLH1 c.2101C>A(Q701K)突变的病例对照分析提示,该突变增加中国男性携带者的胃癌患病风险。RT-PCR分析携带突变及未携带突变胃癌患者的正常组织cDNA,并经克隆测序确定,hMLH1 c.2101C>A 影响 pre-mRNA 剪接,导致hMLHExon18 跳跃。2.RT-PCR及实时定量PCR分析胃癌患者的组织cDNA,发现除了存在正常mRNA 表达产物,且频繁检出 delEx10、delEx11、delEx10-11、delEx16及delEx17异常转录产物。并在多株体外培养正常胃粘膜细胞及胃癌细胞株的检测中得到验证,且这些异常剪接产物的表达丰度在癌细胞中显著增加。提示这些选择性剪接也是一种普遍现象。3.我们前期并未检出hMLH1 Exon10-11及16-17区域及邻近内含子序列的结构变异,遗传学改变对hMLH1 Exon10-11和Exon16-17区域选择性剪接的影响可以排除。因此,我们猜测表观遗传修饰可能影响hMLH1 pre-mRNA选择性剪接的形成。我们首先检测了 hMLH1 Exon10、11、16及Exon17序列的甲基化状态,分析其与hMLH1各种异常剪接产物的关系。结果表明,胃粘膜细胞与三种胃癌细胞中hMLH1 Exon10、11、16及17序列均存在DNA高甲基化。DNA甲基化转移酶抑制剂AZA处理前后,hMLH1各种异常剪接产物(hMLH1 delEx10、delEx11、delEx10-11、delEx16及delEx17)表达水平均未见显著差异。提示DNA甲基化水平对MLH1选择性剪接无明显影响。4.染色质免疫共沉淀结果表明,相对于人胃粘膜细胞系GES-1,胃癌细胞系BGC-823与SGC-7901中组蛋白乙酰化水平(H4K16ac和H3ac)在hMLH1基因Exon 10-11处富集程度均较低,推测将导致该区域染色质结构较紧凑,RNAP II延伸速率减慢,有利于评分较低的弱异常剪接位点被识别,提高基因选择性剪接的概率。而TSA处理后,部分胃癌细胞中hMLH1 delEx10-1 1异常剪接降低,进一步证实了该区域降低的乙酰化水平与外显子跳跃相关。而hMLH1 Exon16-17处乙酰化水平在人胃粘膜细胞系与胃癌细胞系间未见规律性差异,TSA处理后也未见改变,提示该区域选择性剪接结局与组蛋白乙酰化水平无直接关系。5.进一步组蛋白甲基化的分析揭示,相对于GES-1细胞,胃癌细胞中在hMLH1基因Exon 10-11及16-17区域组蛋白修饰H3K36me3富集程度均较低。siSETD2干扰后,细胞中异常剪接产物hMLLH1delEx10、delEx11及delEx10-11比例均显著增加,说明降低的H3K36me3水平与该区域跳跃相关。相对于GES-1细胞,胃癌细胞在hMLH1基因Exon 10-11及16-17区域组蛋白修饰H3K4me2富集程度也较低,提示H3K4me2对于该区域选择性剪接的可能影响。同时,siSRSF2干扰后,细胞系中hMLH1基因Exon 10-11跳跃的异常转录产物比例也增加。可能当剪接因子SRSF2水平降低,hMLH1 Exon10-11区域识别正常剪接位点能力降低,相对增加了其他剪接的模式。但是siSRSF2干扰后,未影响hMLH1 Exon 16-17区域的剪接结局,提示该区域剪接位点选择不是经由SRSF2作用的。本论文两部分的研究结果揭示,CDH1胚系突变c.1296C>G造成CDH1基因Exon 9跳跃;hMLH1胚系突变c.2101C>A引起hMLH1基因Exon18跳跃。胃癌细胞中广泛存在异常增高的CDH1 1054del83,及hMLH1 deEx10、ddelEx11、delEx10-11、delEx16及delEx17等选择性剪接产物,其丰度受到序列相关的组蛋白乙酰化水平调节,且受组蛋白特定位点氨基酸残基甲基化H3K36me3水平的影响。其机制可能通过影响剪接因子识别、染色质疏缩和RNA聚合酶II延伸速度等。因此,分析胃癌中pre-mRNA选择性剪接的调控,既要考虑相关基因遗传学改变的作用,也要重视表观遗传修饰变异的影响。