背景多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种中枢神经系统（centralneverous system，CNS）自身免疫性疾病，特征性病理改变包括白质脱髓鞘、炎性细胞浸润、轴突破坏等。MS损伤性病灶形成的病理基础目前尚不十分清楚，一般认为是由T细胞介导的免疫反应引起的的脱髓鞘事件。但最近通过MS病人尸检标本的研究却发现MS在新病灶形成时的最初病理改变与传统认识上经典的MS病理改变不同。广泛的少突胶质细胞凋亡是新损伤形成时最早出现的病理改变之一，在新损伤形成的病理过程中，首先出现少突胶质细胞凋亡，随后在凋亡区出现小胶质细胞聚集，此时髓鞘形态完整，无明显损伤。在此过程之后才出现T、B淋巴细胞的浸润和吞噬斑块的形成、轴突明显损伤等典型病理改变。但引起少突胶质细胞凋亡的原因目前尚不清楚。实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）是研究MS的经典动物模型，在EAE模型中神经细胞的凋亡模式以及与典型病理改变之间的关系尚不明确。阐明MS/EAE早期病理事件的表达模式对明确MS/EAE的发病机制以及寻找早期有效的干预手段都有十分重要的意义。目前发现，线粒体损伤是MS病理过程重要的非免疫损伤机制，MS存在线粒体功能失调，以及更高的能量需求，而且线粒体损伤与细胞凋亡密切相关，但线粒体损伤是否参与了MS/EAE发病早期的病理过程尚不十分清楚。姜黄素是一种植物多酚，目前已发现其具有抗炎、抗氧化等保护作用，在EAE中也展现出一定的神经保护作用。但在MS/EAE中能否保护线粒体，抑制EAE早期细胞凋亡的发生，及其神经保护的机制尚不明确。目的本实验通过构建C57BL/6小鼠EAE模型，探索EAE免疫后整个病理过程中CNS细胞凋亡及线粒体损伤情况，试图进一步明确MS/EAE在出现脱髓鞘等典型病理改变前的最初事件表达情况及其在整个病理过程中表达模式的动态变化以及与脱髓鞘等典型病理改变的关系，并探讨引起MS/EAE最初病理事件的原因和机制。验证姜黄素对EAE小鼠的神经保护作用，并探讨姜黄素能否通过保护线粒体损伤抑制EAE小鼠神经细胞凋亡的发生，进一步阐明姜黄素通过线粒体保护，抑制线粒体凋亡途径引起的神经细胞凋亡的病理机制。方法1.成功构建C57BL/6小鼠EAE模型，根据免疫后时间分为3d、7d、16d（急性期）、30d（慢性期）四组及正常组小鼠，采用TUNEL原位凋亡检测、透射电镜、ATP水平检测、免疫荧光双标等技术动态观察EAE小鼠CNS神经细胞凋亡及线粒体损伤的情况及其在免疫后不同时间点表达变化情况。观察凋亡、线粒体损伤程度与髓鞘损伤、轴突破坏等典型病理改变之间的联系。2. C57BL/6小鼠分成正常组、EAE模型组、对照组、姜黄素组，其中后三组又根据EAE病程不同分成发病急性期（16d）与慢性期（30d）两组，姜黄素组自免疫日起每日腹腔注射姜黄素（200mg/kg/d）。神经功能评分观察各组小鼠神经功能变化，H-E染色观察脊髓炎性细胞浸润情况，勒克斯坚牢蓝（Luxol fast blue, LFB）染色观察脊髓髓鞘损伤程度，Bielschowsky银染观察脊髓轴突损伤水平，免疫组化法观察星形胶质细胞激活情况，TUNEL原位凋亡检测及caspase-3免疫组化观察各组小鼠凋亡水平的不同。3. C57BL/6小鼠分成正常组、EAE模型组、对照组、姜黄素组，其中后三组又根据免疫后时间点分成3d、7d、16d、30d组。通过westernblot观察不同时间点caspase-3、caspase-9、Cytochrome c(cyt-c)、MBP、NRF2的表达水平，ATP水平检测试剂盒检测各组ATP表达水平的动态表达情况。动态研究姜黄素通过保护线粒体，抑制线粒体损伤途径介导的神经细胞凋亡的相关机制。结果1. TUNEL原位凋亡检测示EAE小鼠免疫后3d时脊髓即检测到细胞凋亡的发生，细胞凋亡水平以急性期16d时为最高（P＜0.05）。经免疫荧光双标染色证实，3d时凋亡的细胞为少突胶质细胞与神经元。同时免疫后3d时已出现线粒体ATP水平的下降（P＜0.01），ATP水平至急性期16d时为最低（P＜0.05）。透射电镜证实免疫后3d时脊髓组织已出现线粒体肿胀、线粒体嵴被挤向周围等线粒体形态异常，而此时髓鞘及轴突形态无异常。至免疫后16d时电镜可见到脊髓髓鞘板层破坏，轴浆萎缩等典型病理变化，并伴随线粒体肿胀、空泡样变甚至溶解等线粒体广泛病变。2.姜黄素组EAE小鼠较EAE模型组神经功能显著提高（P＜0.05），发病时间明显延后（P＜0.05）。H-E染色示姜黄素组炎性细胞浸润比同时间点模型组明显减轻（P＜0.05），无“血管袖套样”典型炎性病变。LFB染色示姜黄素组髓鞘脱失程度与模型组比较轻，髓鞘缺失区域明显减少（P＜0.05）。Bielschowsky银染示姜黄素组在急性期及慢性期轴突损伤情况均较同时间点模型组为轻。免疫组化示姜黄素组免疫后16d时星形胶质细胞激活水平明显低于同时间点模型组（P＜0.01），但于免疫后30d时两组并无明显统计学差异（P＞0.05）。TUNEL原位凋亡及caspase-3检测示姜黄素能显著抑制急性期及慢性期EAE小鼠神经细胞凋亡水平（P＜0.05）。3. western blot示EAE模型组髓鞘MBP水平自免疫后16d开始显著降低，姜黄素能明显抑制MBP水平的降低（P＜0.05），抑制髓鞘损伤。姜黄素组在免疫后7d、16d、30d时均能明显抑制凋亡标记物caspase-3的表达（P＜0.05）以及线粒体ATP水平的降低（P＜0.05）。4. EAE模型组线粒体凋亡途径关键蛋白cyt-c、caspase-9的表达于免疫后7d时显著增高（P＜0.01），此后一直持续高表达水平（P＜0.01）。与EAE组比较，姜黄素能显著抑制cyt-c、caspase-9表达水平的增高（P＜0.05）。与正常组比较，EAE模型组NRF2水平显著增加见于免疫后7d时（P＜0.05），此后一直持续高表达；而与同时间点模型组比较，姜黄素组NRF2表达水平更高（P＜0.01）。结论1. EAE小鼠免疫后三天即发生了神经细胞凋亡，凋亡细胞为少突胶质细胞与神经元。细胞凋亡发生于脱髓鞘、轴突损伤等典型病理改变出现之前，是EAE的早期病理事件，且凋亡水平与EAE的疾病严重程度呈一致性。2.姜黄素可通过抑制细胞凋亡的程度、抑制线粒体损伤程度、抑制炎性细胞浸润、轴突损伤等发挥对EAE小鼠的神经保护作用。3.姜黄素通过保护线粒体功能，抑制线粒体凋亡途径关键蛋白cyt-c的释放，进而抑制线粒体损伤介导的细胞凋亡的发生。姜黄素对线粒体功能的保护作用可能与其促进NRF2的表达有关。姜黄素对EAE小鼠早期细胞凋亡的影响对寻找MS早期干预以及预防疾病复发的有效手段提供了重要的临床思路和治疗策略。