小菜蛾Plutella xylostella（L.）是危害十字花科植物的世界性迁飞害虫,小菜蛾强大的生殖能力是其种群暴发的重要内因之一。新基因是指物种特异性的、与其他物种没有同源性的基因。大部分的研究表明新基因可参与到生物的生殖调控且对雄性的适应性进化有重要作用。因此,从新基因的角度出发,探索可以调控小菜蛾雄虫生殖能力的基因可为小菜蛾的特异性防控靶位点的开发提供新线索。本研究中,我们鉴定并验证了一个可编码小菜蛾精液蛋白的新基因,将其命名为Tssor-2,并在转录水平和蛋白水平分析了新基因Tssor-2在小菜蛾不同发育历期、不同组织的表达模式;在此基础上,利用CRISPR/Cas9技术敲除该基因,分析敲除品系表型的变化,表明编码精液蛋白的新基因Tssor-2对小菜蛾雄虫的影响。主要结果如下:小菜蛾新基因Tssor-2的基因全长522bp,不含内含子区域,预计编码173个氨基酸,前20个氨基酸为信号肽,不含跨膜结构域。荧光定量PCR结果表明,新基因Tssor-2在雄成虫时期高表达,在雄成虫不同组织的表达量测定中显示,其在活化精子的重要组织附腺中特异高表达,对Tssor-2基因编码蛋白的免疫荧光组织定位也证实了对应的结果。借助CRISPR/Cas9技术,在Tssor-2的基因序列上设计两个相邻61bp的靶点,通过胚胎显微注射体外转录合成的sg RNA与Cas9 m RNA来获得缺失2bp的Tssor-2基因突变纯合品系。免疫荧光与LC/MS的结果证实Tssor-2编码蛋白的缺失,说明该基因被成功的敲除。在表型测定中观察到,与野生型相比,突变体雄虫主要生殖器官没有明显的形态和大小变化。在同与野生型雌虫交配的情况下,突变体雄虫在第二天所产的后代卵的数量和孵化率显著低于野生型雄虫。基于小菜蛾具有多次交配的行为,进一步的研究表明,Tssor-2功能缺失可显著降低雄虫的育性及精子的竞争能力。为了初步了解该基因在雄虫中的作用机制,解析基因可能参与的代谢通路,我们基于RNA-seq对Tssor-2参与的代谢通路、调控网络进行预测。KEGG与GO的结果表明,新基因Tssor-2参与了小菜蛾精子发生过程相关的代谢通路,主要包括TCA循环和糖酵解在内的糖代谢途径,脂代谢途径和胰岛素信号通路等。基于上述实验和RNA-seq数据,我们推测Tssor-2基因编码的蛋白是一个影响雄虫育性和精子竞争力的重要的辅助分泌蛋白,可通过胰岛素代谢、脂肪酸代谢、糖代谢等通路参与调控雄虫的生殖发育。本研究克隆获得小菜蛾的新基因Tssor-2,借助CRISPR/Cas9技术来解析该基因在雄性小菜蛾生殖调控中的作用,我们的结果为小菜蛾及其他物种的新基因研究提供了新的参考,为小菜蛾生殖生理的研究提供了新的见解并可为开发特异性防控小菜蛾靶标提供基础。