论文部分内容阅读
多功能脂质体作为基因载体,在基因治疗中的应用越来越受到重视,展现出了广阔的应用前景。本文以叶酸-聚乙二醇-胆固醇半琥珀酸酯(F-PEG-CHEMS)和硬脂酰八聚精氨酸(R8)作为功能成分,构建多功能脂质体,并把它作为ASODN和质粒DNA的载体,考察其理化性质和细胞的摄取行为与转染效果,探索其作为基因药物细胞内给药系统的可行性。首先,本文在调研有关文献基础上,设计出了胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS)、聚乙二醇单甲醚-胆固醇半琥珀酸酯(MPEG-CHEMS)和F-PEG-CHEMS的合成路线。CHEMS是以胆固醇和丁二酸酐为原料通过酯化反应制备；MPEG-CHEMS是以聚乙二醇单甲醚(MPEG)和CHEMS为原料通过酯化反应制备；F-PEG-CHEMS的合成分三步完成：首先叶酸与聚乙二醇二胺(NH2-PEG-NH2)反应制备F-PEG2000-NH2,然后胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应制备NHS-CHEMS,最后F-PEG-NH2与NHS-CHEMS反应,得到F-PEG-CHEMS。合成并纯化的产物经TLC, IR,.1H-HMR质谱和1H-HMR谱分析,确证为目标产物。合成并纯化了的脂质体膜材MPEG-CHEMS与F-PEG-CHEMS,为多功能脂质体的制备奠定了基础。其次,用薄膜分散法制备普通脂质体,并把R8水溶液与普通脂质体在45℃孵育1h,制备R8修饰的脂质体(R8-Lip),同时对其进行理化性质和细胞水平的评价。实验结果表明,普通脂质体经R8修饰后,粒径和分布基本不变,而zeta电位由-10.24mV变为+38.69mV。当R8-Lip/ASODN复合物中+／-超过4：1时,ASODN已与R8-Lip完全结合成带正电的复合物；当R8-Lip中R8的浓度小于10μg/mL时,细胞存活率大于75%;R8-Lip对ASODN细胞摄取的促进作用与R8的浓度有关,当R8的质量浓度由0.3μg/mL增加到9.6μg/mL(+／-由1：2增加到16：1),细胞内荧光强度逐渐增加；当R8-Lip/ASODN复合物中+／-=16：1时,R8对ASODN摄取的促进作用强于市售的转染试剂Lipofectamine2000。在R8-Lip表面PEG化修饰后,促进细胞摄取ASODN的效果很差。为了进一步提高细胞摄取效果,在PEG末端接上叶酸配体,构建了多功能脂质体R8-Lip-F,并对其进行理化性质和细胞水平的评价。实验结果表明,该脂质体的形态规整,几乎全部呈球形。R8-Lip-F/ASODN在+／-为16：1时复合物完全被阻滞在上样口。R8-Lip-F/ASODN复合物在6h内的细胞摄取量和阳性率随时间的增加而增加。R8-Lip-F/ASODN复合物通过内吞途径入胞,且具有能量依赖性。其入胞机制主要是网格蛋白介导的内吞和巨胞饮作用,并且细胞摄取量会因叶酸的竞争性抑制而降低。ASODN入胞后大部分分布在胞浆中,细胞核中几乎没有。与市售的转染试剂Lipofectamine2000相比,R8-Lip-F对ASODN摄取的促进作用要强一些,但其对质粒DNA的转染几乎无促进作用,转染效果远差于市售的转染试剂Lipofectamine2000。最后,以DOTAP脂质体为基础,并在其中引入F-PEG-CHEMS与R8,构建多功能阳离子脂质体R8-DOTAP-F,同时对其进行理化性质和细胞水平的评价。实验结果表明,R8-DOTAP-F的形态规整,几乎全部呈球形。在R8-DOTAP-F复合物中DOTAP与pDNA或ASODN质量比为30(正负电荷比或N/P约为13：1)时,pDNA和ASODN被结合完全。R8-DOTAP-F/ASODN复合物在6h内的细胞摄取量和阳性率随时间的增加而增加。对脂质体进行叶酸配体修饰,可以明显提高脂质体复合物的细胞摄取与转染效果,并且,对脂质体进行R8修饰可以进一步提高细胞转染与摄取效果。R8-Lip-F/ASODN复合物通过内吞途径入胞,且具有能量依赖性。其入胞机制主要是网格蛋白介导的内吞和巨胞饮作用,并且细胞摄取量会因叶酸的竞争性抑制而降低。入胞后ASODN大部分分布在细胞核中,溶酶体中几乎没有。与市售的转染试剂Lipofectamine2000相比,R8-DOTAP-F对ASODN摄取的促进作用要强很多,但其对质粒DNA转染的促进作用要略差一些。